М.Е. Дзержинський, доктор біол. наук, І.М. Варенюк, кандидат біол. наук, А.С. Пустовалов, кандидат біол. наук
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ
Summary. The avian acute oral toxicity test (avian single-dose LD50) for new pesticides "Flutrin "(flutriafol — 250 g/l) and "Milakos" (nicosulfuron — 40 g/l) was provided. Japanese quails (Cotumix cotumix japonica) were treated with a single oral dose of one of these pesticides in different doses. It was shown that LD50 of "Flutrin “ was 1181±53 mg/kg body weight, LD50 of "Milakos" was 33442±2394 mg/kg body weight. Signs of intoxication of pesticide "Flutrin " are hypoactivity, ruffled feathers, leg weakness, birds can sit or lie down. General mortality observed from 12 hours to 3 days after injection. Symptoms of intoxication disappear within the first week (maximum — after 9 days) from the time of administration of this pesticide. Signs of intoxication ofpesticide "Milakos" are hypoactivity and ruffledfeathers, birds can sit down. General mortality observed in 9–48 hours after injection. Symptoms of intoxication last up to 9 days. Complete disappearance of symptoms is slow. Females are more sensitive to both pesticides than males.
Key words: pesticides, flutriafol, nicosulfuron, acute oral toxicity test, LD50, birds.
Вступ. На сьогодні пестициди все більш широко застосовуються у сільському господарстві, а тому особливого значення набуває перевірка їхнього токсичного впливу на тваринний та людський організми [3–6, 8]. Одним із важливих етапів токсиколого-гігієнічної перевірки нових пестицидів є визначення їхньої гострої токсичності. Метою даної роботи було визначити напівлетальну дозу (LD50) нових пестицидів "Флутрин" (діюча речовина: флутріафол — 250 г/л) та "Мілакос" (діюча речовина: нікосульфурон — 40 г/л) при пероральному введенні для представника класу птахів — японського перепела (Cotumix cotumix japonica).
Матеріали та методи досліджень. Дослідження було проведено на 112 самцях й 82 самицях японського перепела (Cotumix cotumix japonica) 8–12 тижневого віку. Птахів утримували в умовах стаціонарного віварію, кожна експериментальна група знаходилася в окремій клітці, призначеній саме для вирощування птахів. Світловий режим: 14 годин — світло, 10 годин — темрява. Температура повітря у віварії підтримувалася на рівні +(22 °С–24 °С). Вода подавалась без обмежень у спеціальних пташиних поїлках. Воду замінювали 1 раз на добу. Годівлю проводили без обмежень комбікормом для перепелів марки ПК 1–22П виробництва AT "Київ-Атлантик Україна".
Основні етапи досліджень були проведені у відповідності з методичними вказівками з гігієнічної оцінки нових пестицидів [7], правилами Американської агенції з охорони навколишнього середовища для пестицидів та токсичних субстанцій [1] та іншими рекомендаціями з токсикологічних досліджень [2].
Для приблизного визначення токсичної дози препаратів "Флутрин" та "Мілакос" спочатку були проведені попередні дослідження. Для них взяли 30 самців японських перепелів.
З них сформовали такі експериментальні групи птахів (по 3 самці у кожній групі):
1) "Флутрин" у дозі 100 мг/кг маси тіла — 1 мл "Флутрину" + 99 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
2) "Флутрин" у дозі 1000 мг/кг маси тіла — 1 мл "Флутрину" + 9 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
3) "Флутрин" у дозі 2000 мг/кг маси тіла — 2 мл "Флутрину" + 8 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
4) "Флутрин" у дозі 5000 мг/кг маси тіла — 5 мл "Флутрину" + 5 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
5) "Мілакос" у дозі 100 мг/кг маси тіла — 1 мл "Мілакосу” + 99 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
6) "Мілакос" у дозі 1000 мг/кг маси тіла — 1 мл "Мілакосу” + 9 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
7) "Мілакос" у дозі 10000 мг/кг маси тіла — нерозведений "Мілакос" — ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
8) "Мілакос" у дозі 20000 мг/кг маси тіла — нерозведений "Мілакос" — ввели по 2 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
9) "Мілакос" у дозі 40000 мг/кг маси тіла — нерозведений "Мілакос" — ввели по 4 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
10) "Мілакос" у дозі 50000 мг/кг маси тіла — нерозведений "Мілакос" — ввели по 5 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
Після введення препарату за піддослідними птахами перші 2–3 години вели неперервні спостереження, а потім — періодичні через кожні 2–3 години (для перших 12 годин після введення препарату) і через кожні 12 годин протягом наступних 3-х діб. Спостерігали за наявністю чи відсутністю симптомів отруєння, часом їх появи та зникнення, а також реєстрували час загибелі (якщо смерть мана місце) кожного піддослідного птаха. Щ результати були використані для планування основних досліджень.
З метою остаточного визначення напівлетальної дози пестицидів "Флутрин" та "Мілакос" проведено основні дослідження. Так, було використано 82 самці та 82 самиці японських перепелів. Після отримання птахи були акліматизовані до умов віварію. Щоб врахувати можливі статеві відмінності щодо чутливості перепелів до вищезазначених пестицидів у кожну експериментальну групу брали порівну самців та самиць.
З цих перепелів було сформовано наступні експериментальні групи:
1) контрольна група — ввели дистильовану воду;
2) "Флутрин" у дозі 1000 мг/кг маси тіла — 5 мл "Флутрину" + 45 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
3) "Флутрин" у дозі 1100 мг/кг маси тіла — 5,5 мл "Флутрину" + 44,5 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
4) "Флутрин" у дозі 1200 мг/кг маси тіла — 6 мл "Флутрину" + 44 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
5) "Флутрин" у дозі 1300 мг/кг маси тіла — 6,5 мл "Флутрину" + 43,5 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
6) "Флутрин" у дозі 1400 мг/кг маси тіла — 7 мл "Флутрину" + 43 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
7) "Флутрин" у дозі 1500 мг/кг маси тіла — 7,5 мл "Флутрину" + 42,5 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
8) "Флутрин" у дозі 1600 мг/кг маси тіла — 8 мл "Флутрину" + 42 мл дистильованої води — розчин ввели по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
9) "Мілакос" у дозі 25000 мг/кг маси тіла — нерозведений "Мілакос" — ввели по 2,5 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
10) "Мілакос" у дозі 30000 мг/кг маси тіла — нерозведений "Мілакос" — ввели по 3 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
11) "Мілакос" у дозі 35000 мг/кг маси тіла — нерозведений "Мілакос" — ввели по 3,5 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
12) "Мілакос" у дозі 40000 мг/кг маси тіла — нерозведений "Мілакос" — ввели по 4 мл на кожні 100 г маси тіла птаха;
13) "Мілакос" у дозі 45000 мг/кг маси тіла — нерозведений "Мілакос" — ввели по 4,5 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
Безпосередньо перед введенням вищевказаних препаратів птахів зважували. Дозу пестициду розраховували індивідуально для кожного птаха, виходячи з маси його тіла. Відповідну кількість препарату одноразово вводили перорально за допомогою спеціального шприца для внутрішньогортанних вливань.
Після введення препарату за птахами вели неперервні спостереження перші 3 години після введення препарату, а потім — регулярні через 6, 9,12, 24, 36 та 48 годин після введення препарату, а в подальшому — 1 раз на добу. Спостерігали за наявністю чи відсутністю симптомів отруєння, часом їх появи та зникнення, а також — за часом загибелі (якщо смерть мала місце) кожного піддослідного птаха. Спостережний період становив 14 діб.
Напівлетальну дозу (ЛД50) пестицидів "Флутрин" і "Мілакос", стандартну похибку та 95 %-й довірчий інтервал (довірчий інтервал при Р<0,05) розраховували методом графічного пробіт-аналізу [9].
Результати досліджень та їх обговорення. Попередні дослідження: 3 таблиці 1 видно, що при введенні пестициду "Флутрин" у дозі 1000 мг/кг маси тіла ніхто з перепелів не гине, а при введенні вищевказаного препарату у дозі 2000 мг/кг гинуть всі 3 перепели. Отже, на основі попередніх досліджень можна зробити висновок, що напівлегальна доза (ЛД50) пестициду "Флутрин" для птахів знаходиться між 1000 мг/кг маси тіла та 2000 мг/кг маси тіла.
Таблиця 1. Результати попередніх досліджень для пестицидів "Флутрин" та "Мілакос"
З таблиці 1 також видно, що при введенні пестициду "Мілакос" у дозі 100 мг/кг маси тіла будь-які симптоми отруєння відсутні, а з’являються при введенні вищевказаного препарату у дозі 1000 мг/кг. Оскільки після введення пестициду "Мілакос" у дозі 20000 мг/кг маси тіла ніхто з перепелів не гине, а після введення пестициду "Мілакос" у дозі 50000 мг/кг маси тіла гинуть всі перепели у групі, то можна зробити висновок, що напівлегальна доза (ЛД50) пестицида "Мілакос" для птахів знаходиться між 20 000 мг/кг маси тіла та 50 000 мг/кг маси тіла.
Основні дослідження пестицида "Флутрин". Як вже зазначалося, піддослідні птахи були до початку експерименту акліматизовані, за цей час протягом першої доби загинули 2 перепели, що, мабуть, було пов’язане зі стресом під час транспортування. В подальшому ніхто з перепелів не загинув і в жодної з особин не було помітно будь-яких ознак хвороб.
У перепелів контрольної групи, які перорально отримали чисту дистильовану воду, фактів смертності та будь-яких симптомів отруєння чи аномальної поведінки не зафіксовано.
Результати основних досліджень для пестициду ’'Флутрин" представлені у таблиці 2. Видно, що після перорального введення пестициду "Флутрин" майже в усіх перепелів протягом перших кількох годин з’являється гіпоактивність та реакція "опущене пір’я", частина перепелів сидить, у незначної частини перепелів, які отримали більшу дозу, може бути п’яна хода", тварини можуть лежати. Основна смерт
ність спостерігається через 12 год — 3 доби після введення препарату. У перепелів, що вижили, симптоми отруєння, як правило, зникають протягом першого тижня (максимум — через 9 діб) від часу введення цього пестициду. Самиці є більш чутливими до препарату, ніж самці.
Таблиця 2. Смертність та симптоми отруєння у японських перепелів після однократного введення різних доз пестициду "Флутрин"
На основі одержаних даних методом графічного пробіт-аналізу було розраховано напівлетальну дозу (ЛД50) (рис. 1А). З цього малюнка видно, що напівлетальна доза (ЛД50) пестицида "Флутрин", яка відповідає значенню X на кривій "доза–ефекг" при Y=5, становить 1181 мг/кг маси тіла.
Рис. 1. Крива "доза-ефект" для японських перепелів при введенні пестицидів "Флутрин” і "Мілакос".
Стандартна похибка становить:
95 %-й довірчий інтервал (довірчий інтервал при Р<0,05) становить:
Таким чином, напівлетальна доза (ЛД50) пестициду "Флутрин" для птахів (японських перепелів, Cotumix cotumix japonica) при пероральному однократному введенні становить 1181±53 мг/кг маси тіла, а 95 %-й довірчий інтервал (довірчий інтервал при Р<0,05) — від 1077 до 1285 мг/кг маси тіла.
Основні дослідження пестициду "Мілакос": Після перорального введення пестициду "Мілакос" у всіх перепелів з’являється гіпоактивність та реакція "опущене пір’я", значна частина перепелів, які отримали більшу дозу, сидить (табл. 3). Основна смертність спостерігається через 9–48 год після введення препарату. Симптоми отруєння тривають до 9 діб. Повне зникнення симптомів, як правило, проходить повільно. Самиці є більш чутливими до пестицида "Мілакос", ніж самці.
Таблиця 3. Смертність та симптоми отруєння у японських перепелів після однократного введення різних доз пестициду "Мілакос"
Розрахована за методом графічного пробіт-аналізу напівлетальна доза (ЛД50) пестициду "Мілакос" (рис. 1Б), яка відповідає значенню X на кривій "доза–ефект" при Y=5, становить 33442 мг/кг маси тіла.
Стандартна похибка становить:
95 %-й довірчий інтервал (довірчий інтервал при Р<0,05) становить:
Таким чином, напівлетальна доза (ЛД50) пестициду "Мілакос" для птахів (японських перепелів, Cotumix cotumix japonica) при пероральному однократному введенні становить 33442±2394 мг/кг маси тіла, а 95 %-й довірчий інтервал (довірчий інтервал при Р<0,05) — від 28749 до 38135 мг/кг маси тіла.
ЛІТЕРАТУРА
1. Guidelines United States Environmental Protection Agency: Pesticides and Toxic Substances: Avian acute oral toxicity test. — Washington, 1996.
2. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов / [Е.Ю. Афанасьева, Е.Я. Борисова, O.JI. Верстакова, В.Б. Герасимов, С.А. Еремин] — Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2008, — 1016 с.
3. Экологическая токсикология / [В.С. Безель, Е.А. Вельский, Д.В. Веселкин и др.] — Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2001.— 135 с.
4. Ісаєнко В.М. Основи екологічної токсикології / В.М. Icaєнко. — Київ: НАУ, 2007, — 67 с.
5. Основы токсикологи / [П.П. Кукин, H.JI. Пономарев, К.Р.Таранцева и др.] — Москва: Высшая школа, 2008. — 279 с.
6. Пестициды: Справочник /[ В.И. Мартыненко, В.К. Промоненков, С.С. Кукаленко и др.] — Москва: Агропромиздат, 1992, — 368 с.
7. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов, — Киев, 1988. — 212 с.
8. Основи токсикології / [Г.Г. Рощин, А.П. Строкань, А.С. Тимченко и др.] — Київ: КНУТД, 2007. — 138 с.
9. Ступников А.А. Токсичность гербицидов и арборицидов и профилактика отравлений животных / А.А. Ступников. — Ленинград: Колос, 1975. — 240 с.\
REFERENCES
1. Guidelines United States Environmental Protection Agency: Pesticides and Toxic Substances: Avian acute oral toxicity test. — Washington, 1996.
2. Toksikologicheskaya khimiya. Metabolizm i analiz toksikantov / [E.Yu. Afanas'eva, E.Ya. Borisova, O.JI. Verstakova, V.B. Gerasimov, S.A. Eremin] — Moskva: GEOTAR-Media, 2008, — 1016 s.
3. Ekologicheskaya toksikologiya / [V.S. Bezel', E.A. Vel'skij, D.V. Veselkin i dr.] — Ekaterinburg: Izd-vo Ural'skogo un-ta, 2001.— 135 s.
4. Isayenko V.M. Osnovy ekolohichnoi toksykolohii / V.M. Icayenko. — Kyiv: NAU, 2007, — 67 s.
5. Osnovy toksikologi / [P.P. Kukin, H.JI. Ponomarev, K.R.Taranceva i dr.] — Moskva: Vysshaya shkola, 2008. — 279 s.
6. Pesticidy: Spravochnik /[ V.I. Martynenko, V.K. Promonenkov, S.S. Kukalenko i dr.] — Moskva: Agropromizdat, 1992, — 368 s.
7. Metodicheskie ukazaniya po gigienicheskoj ocenke novykh pesticidov, — Kiev, 1988. — 212 s.
8. Osnovy toksykolohii / [H.H. Roschyn, A.P. Strokan', A.S. Tymchenko y dr.] — Kyiv: KNUTD, 2007. — 138 s.
9. Stupnikov A.A. Toksichnost' gerbicidov i arboricidov i profilaktika otravlenij zhivotnykh / A.A. Stupnikov. — Leningrad: Kolos, 1975. — 240 s.
Надійшла до редакції 2.12.2014 p.