Изучение влияния альбуминизации делигандизирующих углеродных гемосорбентов на их сорбционную активность

  • Авторы: Л.А. Юшко, Л.А. Сахно, В.В. Сарнацкая, В.Н. Масленный, В.Г. Николаев
  • УДК: 616:615.015:615.373: 546.26
Скачать вложения:

Л.О. Юшко, Л.О. Сахно, к.біол.н., В.В. Сарнацька, к.біол.н., В.М. Масленний, к.біол.н., В.Г. Ніколаєв, д.мед.н., проф.

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ

РЕЗЮМЕ: Изучение удаления водорастворимых и гидрофобных метаболитов из цельной крови донора в процессе гемоперфузии in vitro через колонки с непокрытым делигандизирующим гемосорбентом ГСГД и ГСГД, покрытым делигандизированным человеческим сывороточным альбумином и его В-конформером (рН 8,0) показало, что используемые покрытия максимально сберегают сорбционный потенциал углеродной матрицы в отношении мочевой кислоты, креатинина, L-триптофана и неконъюгированного билирубина на фоне снижения адсорбции общего белка и альбумина. Использование для покрытия гемосорбентов ГСГД одного из важнейших компонентов плазмы крови — альбумина является перспективным подходом для повышения их гемосовместимости.
Ключевые слова: водорастворимые и гидрофобные метаболиты, делигандизирующие гемосорбенты, человеческий сывороточный альбумин, В-конформер ЧСА.

Проблема створення гемосорбентів, що поєднують значну сорбційну активність з високою біосумісністю та призначені для глибокого очищення плазми та мембран клітин крові хворих, не втрачає своєї актуальності й нині. Велике значення для рішення цієї проблеми мала розробка вуглецевих масфрактальних пірополімерів — делігандизуючих гемо-, плазмосорбентів (ГСГД), здатних забезпечити швидку кінетику масообміну, необхідну для формування високого сорбційного потенціалу щодо не тільки до водорозчинних, а й до гідрофобних метаболітів, міцно зв'язаних з білками і мембранами клітин крові [1]. Слід зазначити також високу поглинальну ємність ГСГД до білкових молекул [2], що відкриває можливість синтезу комбінованих білок-вуглецевих сорбентів з метою підвищення гемосумісності ГСГД та надання їм біоспецифічних властивостей. Для того, щоб мінімізувати при цьому втрату сорбційної активності щодо білок-зв'язаних речовин у якості покриття нами використані делігандизований сироватковий альбумін людини (САЛ), а також його В-конформер (рН 8,0). Делігандизований САЛ на відміну від фармакопейного препарату має істотно підвищену акцепторну ємність щодо білок-зв'язаних метаболітів за рахунок видалення під час сорбційної делігандизації САЛ великої частини гідрофобних лігандів [3]. Структурно-функціональні перебудови у молекулі білка, що відбиваються у процесі отримання В-конформеру під впливом зміни рН, також сприяють збільшенню його комплексоутворюючого потенціалу. Так, вивчення впливу покриття конформерами САЛ вуглецевих пірополімерів ГСГД на їх здатність видаляти під час перфузії in vitro білок-зв'язані "печінкові" та "ниркові" токсини з модельних альбумін-вмісних розчинів показало, що В-конформери певною мірою зберігають сорбційні властивості вуглецевої матриці [4].

Мета дослідження полягала у вивченні впливу альбумінізації делігандизуючих вуглецевих гемосорбентів на ефективність видалення водорозчинних та білок-зв'язаних метаболітів з цільної крові донора.

Дослідження були проведені за підтримки цільової наукової програми НАН України "Фундаментальні основи геноміки і протеоміки", № держреєстрації 0107U002244.

Матеріали і методи

У роботі використано делігандизуючі гемосорбенти ГСГД з насипною вагою 0,17 г/см3 та наступні реактиви: креатинін, білірубін (Merсk, Німеччина), L-триптофан (ООО "Хімлаборреактив", Україна) та фармакопейний розчин донорського САЛ (ЗАО "Біофарма", Україна).

Сорбційна делігандизація донорського САЛ була виконана за методом Chen RF [5]. В-конформер делігандизованого САЛ був отриманий шляхом зміни іонної атмосфери білка до рН 8,0 за допомогою 1N розчину гідроксиду натрію. Альбумінізація ГСГД включала інкубацію у розчині отриманого делігандизованого САЛ та у розчині його В-конформеру при температурі 4°С протягом не менше 12 годин. Насичені альбуміном сорбенти переносили у колонки та відмивали натрій-фосфатним буфером (рН 7,2) до відсутності слідів білка.

Перфузія крові проводилась через колонки об'ємом 5 см3 зі швидкістю 0,625 мл/хв протягом 2 годин. Перед початком перфузії у кров донора (відділення переливання крові, Національний інститут раку МОЗ України) було введено додаткову кількість креатиніну, білірубіну та L-триптофану. Проби крові на аналіз відбирались на початку та після перфузії з пулу та на виході з колонки. Вміст L-триптофану у плазмі крові визначався спектрофлюориметричним методом після осадження білків та конденсації L-триптофану з утворенням флюорофору [6], вміст решти метаболітів — за стандартними біохімічними методами [7]. Величину адсорбції (поглинальну ємність) визначали за зниженням вмісту метаболіту в крові та розраховували на 1 г сорбенту.

Результати дослідження та їх обговорення

У результаті 2-годинной перфузії крові через колонки з непокритим ГСГД (ГСГД) та ГСГД, покритим делігандизованим САЛ (ГСГД+ дСАЛ) і його В-конформером (ГСГД+В-конф.), вміст водорозчинних метаболітів у крові знижувався — сечової кислоти на 78,1; 83,0 та 84,0 % відповідно (рис. 1А), креатиніну на 83,0; 85,2 та 86,0 % відповідно (рис. 1 Б). Адсорбція сечової кислоти становила 2,85 мг на 1 г ГСГД, 3,03 мг — на 1 г ГСГД+дСАЛ та 3,06 мг на1 г ГСГД+В-конф. Поглинальна ємність ГСГД, ГСГД+дСАЛ та ГСГД+В-конф. за креатиніном дорівнювала 2,25; 2,31 та 2,32 мг/г відповідно. Привертає увагу той факт, що обидва альбумінових покриття не тільки не знижували, а й певною мірою підвищували сорбційну активність ГСГД щодо сечової кислоти та креатиніну.

Рис. 2 Поглинання L-триптофану (А) та некон'югованого білірубіну (Б) з крові донора після гемоперфузії

Вміст L-триптофану, відносно слабо зв'язаного з САЛ (Кас= 2,7x104 М-1), зменшувався після перфузії через колонку з ГСГД на 76,4 % , з ГСГД+дСАЛ — на 77,7 % та з ГСГД+В-конф. — на 79,8 % відповідно (рис. 2 А), тобто спостерігалось незначне підвищення сорбційної активності ГСГД після альбумінізації.

Результати адсорбції некон'югованого білірубіну представлені на рис. 2 Б. Максимальне зниження вмісту некон'югованого білірубіну (47,4 %) спостерігалось після перфузії крові через колонку з непокритим ГСГД. Після контакту з ГСГД+дСАЛ та ГСГД+В-конф. вміст некон'югованого білірубіну падав на 36,8 та 42,1 % відповідно. Непокритий ГСГД поглинав 0,46 мг білірубіну на 1 грам сорбенту. Покриття ГСГД делігандизованим САЛ викликало зменшення адсорбції некон'югованого білірубіну (0,36 мг/г) на 21,7 % та покриття В-конформером (0,41 мг/г) лише на 10,9 %. Через 2 години гемоперфузії концентрація некон'югованого білірубіну на виході з колонок, заповнених ГСГД, ГСГД+дСАЛ та ГСГД+В-конф., становила 11; 13 та 12 ммоль/л відповідно, тобто не більше 68,0 % від вихідної концентрації (19 ммоль/л). Це свідчення того, що непокритий та покриті альбуміном ГСГД не вичерпали поглинальної ємності по відношенню до некон'югованого білірубіну.

Розглянемо, як впливає альбумінізація на поглинальну активність ГСГД щодо білка. Після 2-годинной перфузії крові через колонку з ГСГД у пулі було зафіксовано зниження вмісту загального білка та альбуміну на 18,3 та 24,3 % відповідно (рис 3 А і Б). У результаті гемоперфузії через колонку з ГСГД+дСАЛ вміст загального білка і альбуміну падав лише на 2,8 та 5,4 % та через колонку з ГСГД+В-конф. — на 1,4 і 2,7 % відповідно. Поглинальна ємність непокритого ГСГД щодо загального білка та альбуміну становила 1,15 і 0,79 г/г відповідно та була на порядок більшою, ніж поглинальна ємність альбумінізованих ГСГД: величина адсорбції загального білка на ГСГД+дСАЛ та ГСГД+В-конф. дорівнювала 0,17 і 0,09 г/г та альбуміну — 0,18 і 0,09 г/г відповідно. При цьому вже через 2 години гемоперфузії концентрація загального білка та альбуміну на виході з колонок, заповнених ГСГД+дСАЛ та ГСГД+В-конф., практично не відрізнялась від концентрації перед початком процедури. Таким чином, покриття високоємного гемосорбенту делігандизованим альбуміном або його В-конформером надає можливість звести до мінімуму втрату білка під час гемоперфузії, що має особливе значення при хворобах, для яких характерна білкова недостатність, наприклад, у онкологічних хворих у стані кахексії [8], у пацієнтів з тяжкою термічною травмою [9], у хворих з виразними порушеннями білок-синтетичної функції печінки [10].

Рис. 3 Поглинання загального білка (А) та альбуміну (Б) з крові донора після гемоперфузії

Одержані результати показали, що альбумінове покриття і особливо В-конформер незначною мірою покращують адсорбційну активність вуглецевої матриці щодо водорозчинних метаболітів та L-триптофану (рис. 1 А і Б та 2 А).

Пояснюється цей феномен, імовірно тим, що покриття ГСГД альбуміном знижує адсорбцію білків плазми крові на його зовнішній поверхні, отже, запобігає росту дифузного опору на поверхні розділу фаз. Ця гіпотеза підтверджується зменшенням поглинання загального білка та альбуміну на альбумінізованих ГСГД (рис. 3 А і Б). Інтерпретуючи дані з адсорбції некон'югованого білірубіну, слід врахувати те, що відрив цього ліганду, міцно зв'язаного з молекулою альбуміну (Кас= 9,5x107 М-1), відбувається всередині вуглецевого ядра, доступ до якого певним чином ускладнюється будь-яким покриттям, у тому числі й альбуміновим. Цей ефект слабкіше виражений при покритті гемосорбенту В-конформером, що пов'язано з його меншим дифузним опором, обумовленим, вірогідно, стеричними факторами або більшою здатністю В-конформеру бути проміжним субстратом для переносу білірубіну всередину вуглецевого ядра. Отримані дані цілком підтверджують результати досліджень, у яких доведена дифузійна "прозорість" В-конформерного покриття ГСГД для гідрофобних метаболітів в умовах адсорбції з модельних альбумін-вмісних розчинів 4.

Висновки
1. Вивчення впливу покриття делігандизованим САЛ і його В-конформером вуглецевих пірополімерів ГСГД на їх здатність видаляти під час перфузії in vitro водорозчинні та білок-зв'язані токсини з цільної крові донора показало, що використані покриття дозволяють максимально зберігати сорбційний потенціал вуглецевої матриці.
2. Покриття високоємного гемосорбенту делігандизованим альбуміном або його В-конформером надає можливість мінімізувати поглинання білка.
3. Використання для покриття високоактивних вуглецевих гемосорбентів ГСГД альбуміну, одного з найважливійших компонентів плазми крові, слід вважати достатньо перспективним підходом щодо підвищення їх гемосумісності.

 

ЛІТЕРАТУРА

1. New approaches to the removal of protein-bound toxins from blood plasma of uremic patients / V.V. Sarnatskaya, L.A.Yushko, A.V.Nikolaev [et al.] // Biomat. Art. Cells & Artificial Organs. —2007. —Vol.35, №3. — Р. 287-309.

2. Albumine, Bilirubine and Activated Carbon:New Edges of an Old Triangle / V.V.Sarnatskaya, W.E.Lindup, P.Walther [et al.] // Artificial cells, blood substitutes, and immobilization biotechnology. — 2002. — Vol. 30, №2. — Р. 113-127.

3. Albomax as a promising liquid adsorbent for binding hydrophobic markers / V.Sarnatskaya, K. Lobunets, L.Yushko [et al.] // Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. — 1993. — Vol. 17, №6. — P. 487.

4. Биолизация поверхности высокоактивных углеродных адсорбентов конформерами человеческого сывороточного альбумина / В.В. Сарнацкая, Л.А. Юшко, Л.Н. Коренева [и др.] // Эфферентная терапия. —2005. —1, № 3. —С. 10-20.

5. Chen R.F. Removal of fatty acids from serum albumin by charcoal treatment /R.F. Chen // J Biol Chem. — 1967. — Vol. 242, № 2. — Р. 173-81.

6. Denecla W.D. The determination of tryptophan in plasma, liver, and urine/ Denecla W.D. , Dewey H.K. // J Lab Clin Metod. — 1967. — 69. — Р. 160-8.

7. Лабораторные методы исследования в клинике: [справочник / под ред. В.В. Меньшикова]. — Москва: Медицина. — 1987. — 365с.

8. Кавецкий Р.Е. Взаимодействие опухоли и организма / Р.Е. Кавецкий. — Киев: Наук. думка, 1977. — 234 с.

9. Sevitt S. A review of the complications of burns, their origin and importance for illness and death/ Sevitt S. // J Trauma. — 1979. — 19. — P. 358-69.

10. Болезни печени и желчевыводящих путей: [pуководство для врачей / под ред. В.Т. Ивашкина]. — Москва: ООО "Издательский дом М-Вести", 2002. — 416с.

 

REFERENCES

1. New approaches to the removal of protein-bound toxins from blood plasma of uremic patients / V.V. Sarnatskaya, L.A.Yushko, A.V.Nikolaev [et al.] // Biomat. Art. Cells & Artificial Organs. —2007. —Vol.35, №3. — Р. 287-309.

2. Albumine, Bilirubine and Activated Carbon:New Edges of an Old Triangle / V.V.Sarnatskaya, W.E.Lindup, P.Walther [et al.] // Artificial cells, blood substitutes, and immobilization biotechnology. — 2002. — Vol. 30, №2. — Р. 113-127.

3. Albomax as a promising liquid adsorbent for binding hydrophobic markers / V.Sarnatskaya, K. Lobunets, L.Yushko [et al.] // Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. — 1993. — Vol. 17, №6. — P. 487.

4. Biolizaciya poverkhnosti vysokoaktivnykh uglerodnykh adsorbentov konformerami chelovecheskogo syvorotochnogo al'bumina / V.V. Sarnackaya, L.A. Yushko, L.N. Koreneva [i dr.] // Efferentnaya terapiya. —2005. —1, № 3. —S. 10-20.

5. Chen R.F. Removal of fatty acids from serum albumin by charcoal treatment /R.F. Chen // J Biol Chem. — 1967. — Vol. 242, № 2. — Р. 173-81.

6. Denecla W.D. The determination of tryptophan in plasma, liver, and urine/ Denecla W.D. , Dewey H.K. // J Lab Clin Metod. — 1967. — 69. — Р. 160-8.

7. Laboratornye metody issledovaniya v klinike: [spravochnik / pod red. V.V. Men'shikova]. — Moskva: Medicina. — 1987. — 365s.

8. Kaveckij R.E. Vzaimodejstvie opukholi i organizma / R.E. Kaveckij. — Kiev: Nauk. dumka, 1977. — 234 s.

9. Sevitt S. A review of the complications of burns, their origin and importance for illness and death/ Sevitt S. // J Trauma. — 1979. — 19. — P. 358-69.

10. Bolezni pecheni i zhelchevyvodyaschikh putej: [pukovodstvo dlya vrachej / pod red. V.T. Ivashkina]. — Moskva: OOO "Izdatel'skij dom M-Vesti", 2002. — 416s.

Надійшла до редакції: 03.02.10