Влияние бензо[с]фенантридиновых алкалоидов сангвинарина и хелеритрина на восстановление функционального состояния печени крыс после 70% частичной гепатэктомии

  • Авторы: И.В. Зверинский, Н.Г. Мельниченко, И.П. Сутько, В.А. Поплавский, П.Г. Телегин, А.Г. Шляхтун
  • УДК: 577.152.1; 574.94.943
Скачать вложения:

И.В. Зверинский, к.биол.н, Н.Г. Мельниченко, И.П. Сутько, В.А. Поплавский, П.Г.Телегин, А.Г. Шляхтун

ГУ "НПЦ "Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси" лаборатория биохимической токсикологии и наркологии, г. Гродно, Республика Беларусь

РЕЗЮМЕ. Исследовали влияние композиции бензо[c]фенантридиновых алкалоидов, сангвинарина и хелеритрина на процессы восстановления функционального состояния печени крыс после 70% частичной гепатэктомии. Установлено, что к 6-м суткам у животных после операции отмечается увеличение в крови активности лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы и показателей тимоловой пробы. В микросомальной фракции печени отмечается падение содержания и активности монооксигеназ. Совместное введение хелеритрина и сангвинарина в соотношении 1:1,3 и в дозе 5 мг/кг, в/б в течение 4 дней (первая инъекция через 24 часа после операции) приводило к 50% гибели животных и образованию обширных асцитов, резкому росту концентрации общего билирубина в крови. Предполагается, что токсический эффект алкалоидов связан прежде всего с ингибированием процессов ангиогенеза в печени.
Ключевые слова: алкалоиды чистотела, токсические поражения печени, модель-гепатоектомия 70%, восстановление функции печени.

Фармакологическая активность чистотела большого (Chelidonium Majus L.) обусловлена, прежде всего, наличием в нем вторичных метаболитов алкалоидной природы. Алкалоиды чистотела подразделяются на три подгруппы изохинолиновых производных: протобербериновые — берберин, коптизин, стилопин; протопиновые — протопин, аллокриптопин и бензофенантридиновые — хелидонин, гомохелидонин, сангвинарин, хелеритрин [8]. В корневой части растения наибольшее содержание в алкалоидной фракции приходится на хелидонин, а в наземной на коптизин. Сангвинарин и хелеритрин как в траве, так и в корнях чистотела составляют не более 2% от общего содержания алкалоидов, которые, как показывает анализ литературы, обладают широким биологическим действием и в настоящее время рассматриваются в качестве перспективных соединений для разработки новых лекарственных препаратов противоопухолевого действия [5].

В традиционной и народной медицине препараты чистотела часто применяют при заболеваниях печени и желчного пузыря [8]. В тоже время описаны случаи острого поражения печени при назначении препаратов из чистотела [3].

Несмотря на большую метаболическую нагрузку, печень относится к митотически неактивным органам. Обширное токсическое повреждение печени или ее резекция приводит к ее массивной регенерации.

Общепринятой экспериментальной моделью для исследования регенерации печени и тестирования веществ на эти процессы служит 70% частичная гепатэктомия у крыс и мышей [13].

Биотрансформация ксенобиотиков представляет собой принципиальный механизм поддержания гомеостаза во время воздействия на организм чужеродных соединений. Метаболизм ксенобиотиков в организме протекает главным образом в печени. Показано, что в период регенерации печени наблюдается снижение ее способности метаболизировать чужеродные соединения [16], что может быть причинной снижения устойчивости и адаптации организма к химическим веществам окружающей среды, изменения фармакотерапевтической эффективности лекарств, увеличения выраженности и частоты их побочного действия на органы и ткани организма человека и животных.

Сангвинарин и хелеритрин подвергаются ряду метаболических трансформаций в гепатоцитах для их дальнейшей элиминации из организма, в частности последовательному восстановлению, деалкилированию и конъюгации [18]. Ряд клеточных мембранных насосов могут траспортировать эти алкалоиды в неизменном виде, используя для этого восстановленный глутатион [7]. Метаболиты сангвинарина и хелеритрина не проявляют фармакологической активности [18].

Цель настоящего исследования состояла в изучении влияния комбинации сангвинарина и хелеритрина на восстановление функционального состояния печени крыс после 70% частичной гепатэктомии.

Материалы и методы исследований

Опыты проведены на 42 крысах-самцах породы Wistar, массой 180 — 220 г. Частичную гепатэктомию (удаление ~ 70 % массы печени) проводили согласно [11] под эфирным наркозом. Опытные животные были разбиты на две группы. Первой группе вводили 0,85 % раствор NaCl, второй — комбинацию сангвинарина и хелеритрина, в дозе 5 мг/кг, внутрибрюшинно. Первую инъекцию проводили через 24 часа после операции, в последующем один раз в день, на протяжении 3 суток. Животные с ложной операцией служили в качестве контроля, которым назначали физиологический раствор. Через 24 часа после последней инъекции крыс декапитировали.

В плазме и сыворотке крови определяли активность АлАТ, АсАТ, ГГТП, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы и содержание общего билирубина, липидов, холестерина, креатинина, альбумина, показателей тимоловой пробы с использованием аналитических наборов ООО "Анализ-Х" (Минск, Беларусь).

Микросомальную и цитозольную фракции печени выделяли методом дифференциального центрифугирования. Содержание цитохромов Р450 и b5 определяли спектрофотометрическим методом Омура и Сато [9], содержание белка — по методу Лоури [15]. Активность изоформ цитохрома Р450 исследовали по скорости окисления ряда алкоксирезоруфинов по методу Бурке и Майера по образованию резоруфина [6] и наработке формальдегида из аминопирина и этилморфина [14]. Об активности микросомальных флавинсодержащих моноок-сигеназ судили по скорости окисления НАДФН в присутствии их субстратов имипрамина (0,1 mM), тиамина (1 mM), триметиламина (0,1 mM) и N,N-диметиланилина (0,1 mM). Предварительно через инкубационную смесь в течение 1 минуты пропускали СО (для ингибирования цитохрома Р450) [2]. Активность цитозольной и микросомальной глутатион-S-трансфераз определяли по связыванию глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ) и сульфобромфталеином (СБФ) [10].

Выделение гидрохлоридов сангвинарина и хелеритрина проводили из препарата "Сангвиритрин®" (Российская Федерация, 0,2% водно-спиртовой раствор сангвинарина и хелеритрина). Для количественного содержания выделенных алкалоидов использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию. Анализ проводили на хроматографической системе высокого давления Agilent 1200 (Германия) с диодно-матричным детектором. Разделение компонентов смеси проводили на колонке Kromasil (100-5-C18, 4,6 x 150 мм, 5 мкм), подвижной фазой, состоящей 25 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 2,5 и ацетонитрила в объемном соотношении 70/30. Скорость подачи элюента 1,5 мл/мин, температура колонки 35oС. Длина волны детекции — 285 нм. Продолжительность анализа — 15 минут. Прием и обработка хроматограмм осуществлялись с помощью модуля обработки данных Agilent Chem Station B 03 01. Расчет содержания алкалоидов проводили по методу внешнего стандарта. В качестве стандартов использовали sanguinarine chloride и chelerythrien chloride (Sigma-Aldrich, США).

Хроматографический анализ показал, что соотношение хелеритрин:сангвинарин в выделенной фракции алкалоидов составило 1:1,3.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы GraphPad Prism 4.00. Достоверность оценивали по t-критерию Стьюдента. Различия считались достоверными при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Проведенные исследования показали, что на 6-е сутки в I группе, после частичной гепатэктомии у животных отмечается увеличение активности в сыворотке крови лактатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы на 39 и 65% соответственно. Показатели тимоловой пробы были увеличены в сравнении с ложнооперированными животными более чем в два раза. Также отмечено умеренное снижение содержания общих липидов в сыворотке крови (рисунок). В микросомальной фракции печени было зарегистрировано снижение как содержания, так и активности микросомальных монооксигеназ. Так, содержание цитохромов Р450 и b5 снижаются на 60 и 30%% соответственно.

Рис. Некоторые биохимические показатели крови животных в процентах к группе контроля на 6-ые сутки после 70% частичной гепатэктомии без (I) и на фоне введения композиции двух алкалоидов сангвинарина и хелеритрина (II) в дозе 5 мг/кг, внутрибрюшинно.
Примечание. * — р<0,05 к контролю, #— р<0,05 к I группе.

Отмечается снижение каталитической активности метоксирезоруфин-О-деэтилазы (цитохром Р450 1А2-зависимая реакция) и этилморфин-N-деметилазы (цитохром Р450 3А-зависмая реакция) на 69 и 38%% (таблица). Активность микросомальных флавинсодержащих монооксигеназ была снижена на 33-22%. Активность цитозольных глутатион-S-трансфераз также были снижены в сравнении с группой контроля (таблица).

Таблица

Содержание и активность цитохром Р450-зависимых, флавинсодержащих монооксигеназ и глутатион-S-трансфераз печени крыс на 6-е сутки после 70% частичной гепатэктоми без (I группа) и на фоне введения суммы алкалоидов сангвинарина и хелеритрина (II группа) в дозе 5 мг/кг, в/б, в течение 4 дней (М±m).

Таким образом, к 6-м суткам после 70% частичной гепатэктомии в печени крыс наблюдаются признаки холестаза и гепатита, а также умеренное снижение способности печени метаболизировать чужеродные соединения, что, по-видимому, связано с внутрипеченочной холангиостомией и участием иммунной системы в регенерации печени. Подобные биохимические изменения в период компенсаторного роста печени после частичной гепатэктомии были получены и другими исследователями [1, 16].

Назначение суммы алкалоидов сангвинарина и хелеритрина в дозе 5 мг/кг, приводит к 50% гибели животных. У выживших крыс наблюдались обширные асциты. Анализ крови показал резкое увеличение содержания общего билирубина в 2,6 и 1,8 раза в сравнении с контрольной и I группой соответственно (таблица). Назначение комбинации бензофенант-ридиновых алкалоидов сангвинарина и хелеритрина в период регенерации печени приводит к статистически достоверному снижению показателей тимоловой пробы, содержания общих липидов и холестерина в сыворотке крови, а также скорости О-деалкилирования этоксирезоруфина (цитохром Р450 1А1-зависимая реакция), а также к флавинзависимому окислению НАФДН (субстрат тиамин) в микросомальной фракции печени крыс как по отношению к контрольной, так и первой группам. Остальные исследуемые биохимические показатели были на уровне первой группы.

Регенерация печени характеризуется высокой гемодинамической нагрузкой, которая снижается по мере восстановления массы органа и сосудистой структуры печени [13]. Пик синтеза эндотелиальных клеток печени наблюдается через 36 и 98 часов после частичной гепатэктомии. Ведущими хемотаксическими и митогенными стимулами для этих клеток служат ангиопоэтины [4]. Считается, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) — это наиболее мощный ангиогенный фактор, увеличение продукции которого пролиферирующими гепатоцитами после частичной гепатэктомии коррелирует с повышенной экспрессией его рецепторов на поверхности эндотелиальных клеток [20, 19].

Как показывает анализ литературы, сангвинарин способен тормозить как ангиогенез на уровне синтеза VEGF, так и непосредственную рецепторную активацию эндотелиальных клеток VEGF [17]. Супрессивными свойствами в отношении ангиогенеза обладает и хелеритрин [12].

Проведенные исследования показали, что введение композиции алкалоидов сангвинарина и хелеритрина в период регенерации печени сопровождается портальной гипертензией (обширные асциты) и признаками обтурационной желтухи (высокий уровень билирубина, снижение тимоловой пробы), что, вероятно, связано с процессами торможения образования новых эндотелиальных клеток желчных протоков и синусоидов, вследствие резкого снижения общей ксенобиотикометаболической емкости печени в результате массивной хирургической резекции и последующим компенсаторным ростом, который сопровождается ингибированием основных ферментных систем детоксикации и элиминации ксенобиотиков, что приводит к значительному увеличению экспозиции алкалоидов к эндотелиальным клеткам и ингибированию их роста.

ЛИТЕРАТУРА

1. Изучение активности ферментов в процессе регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии нормальной и пораженной дезоксихолевой кислотой печени / Л.Л. Громашевская, М.Г. Касаткина, О.С. Шкурова [и др.] // Укр. биохим. журн. — 1978. — Т.50, №3 — С. 345—251.

2. Мельниченко Н.Г. Активность цитохром Р450-зависимых и флавинсодержащих монооксигеназ печени крыс после введения тиамина и его производных / Н.Г. Мельниченко // Весцi НАН Беларусi сер. мед. нав. — 2007. — №4. — С. 86—89.

3. Acute hepatitis induced by greater celandine (Chelidonium majus) / E. Hardeman, L .Van Overbeke, S. Ilegems [et al.] // Acta. Gastroenterol. Belg. — 2008. — Vol.71, №2. — P. 281—282.

4. Adherent platelets recruit and induce differention of murine embryonic endothelial progenitor cells to mature endothelial cells / H. Langer, A.E. May, K. Daub [et al.] // Circ. Res. — 2006. — Vol. 98. — P. 2—10.

5. Benzo[c]phenanthridine alkaloids exhibit strong anti-prolifer-ative activity in malignat melanoma cells regardless of their p53 status / J. Hammerova, S. Uldrijan, E. Taborska [et al.] // J. Dermatol. Sci. — 2001. — Vol.62, №1, — P. 22—35.

6. Burke M.D. 3-methylcholanthrene-induced monooxygenase (O-deethylation) activity of human lymphocytes / M.D. Burke, R.T. Mayer, R.E. Kouri // Cancer Res. — 1977. — Vol.37, №2. — P. 460—463.

7. Chelerythrine stimulates GSH transports by rat Mrp2 (Abcc2) expressed in canine kidney cells / H. Lou, M. Ookhhens, A. Stolz [et al.] // Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. — 2003. — Vol. 285. — P. G13335—G1344.

8. Colombo M.L. Pharmacological activities of Chelidonium Majus L (Papaveraceae) / M.L. Colombo, E. Bosisio // Pharmacol. Res. — Vol.33, №2. — P. 127—134.

9. Function of cytochrome P-450 of microsomes / T. Omura, R. Sato, D.Y. Cooper [et al.] // Fed. Proc. — 1965. — Vol. 24. — P. 1181—1187.

10. Habig W.H. Glutathione S-transferase. The first enzymatic step in mercapturic acid formation / W.H. Habig, M.J. Pabst, W.B. Jakoby // J. Biol. Chem. — 1974. -Vol.249, № 22. — P. 7130—7139.

11. Higgins G.M. Experimental pathology of the liver / G.M. Huggins, R.M. Anderson // Arch. Pathol. — 1931. —Vol. 12, №2. — P. 186—202.

12. Lane T. Chelerythrine inhibits the secretory response of human blood platelets without specifically inhibiting protein kinase C / T. Lane, P. Novales-Li // Tokai. J. Exp. Clin. Med. — 1996. — Vol.21, №2. — P. 61—67

13. Martins P.N.A. Rodent models of partial hepatectomies / P.N.A. Martins, T. P. Theruvath, P. Neuhans // Liver. International. — 2007. — Vol.28, №1. — P. 3—11.

14. Nash T. The colorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantzsch reaction / T. Nash // Biochem. J. — 1953. — Vol.55, №3. — P. 416—421.

15. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr [et al.] // J. Biol. Chem. — 1951. — Vol.193. — P. 265—275.

16. The microsomal monooxygenase system of regenerating liver / M.J.J. Ronis, C.K. Lumpkin, P.E. Thomas [et al.] // Biochem. Pharmacol. -1992. — Vol.43. — P. 567—573.

17. The plant alkaloid sanguinarine is a potential inhibitor of fol-licular angiogenesis / G. Basini, S.E. Santini, S. Bussolati [et al.] // Reprod. and develop. — 2007. — Vol.53, №3. — P. 573—579

18. Ulrichova J. Toxicology of quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids / J. Ulrichova // Biomed. Papers. — 2005. — Vol.149, Suppl.1. — P. 9—10.

19. Vascular endothelial growth factor and angiopoietins regulate sinusoidal regeneration and remodeling after partial hepatecto-my in rats / H. Shimizy, N. Mitsuhahashi, M. Ohtsura [et al.] // World. J. Gasrtoenterol. — 2005. — Vol.11, №46. — P. 7254—7260.

20. Zachary I. VEGF signaling: integration and multitasking in endothelial cell biology / I. Zachary // Biochem. Soc. Trans. — 2003. — Vol.31. — P. 1171—1177.

 

REFERENCES

1. Izuchenie aktivnosti fermentov v processe regeneracii pecheni krys posle chastichnoj gepatektomii normal'noj i porazhennoj dezoksikholevoj kislotoj pecheni / L.L. Gromashevskaya, M.G. Kasatkina, O.S. Shkurova [i dr.] // Ukr. biokhim. zhurn. — 1978. — T.50, №3 — S. 345—251.

2. Mel'nichenko N.G. Aktivnost' citokhrom R450-zavisimykh i flavinsoderzhaschikh monooksigenaz pecheni krys posle vvedeniya tiamina i ego proizvodnykh / N.G. Mel'nichenko // Vesci NAN Belarusi ser. med. nav. — 2007. — №4. — S. 86—89.

3. Acute hepatitis induced by greater celandine (Chelidonium majus) / E. Hardeman, L .Van Overbeke, S. Ilegems [et al.] // Acta. Gastroenterol. Belg. — 2008. — Vol.71, №2. — P. 281—282.

4. Adherent platelets recruit and induce differention of murine embryonic endothelial progenitor cells to mature endothelial cells / H. Langer, A.E. May, K. Daub [et al.] // Circ. Res. — 2006. — Vol. 98. — P. 2—10.

5. Benzo[c]phenanthridine alkaloids exhibit strong anti-prolifer-ative activity in malignat melanoma cells regardless of their p53 status / J. Hammerova, S. Uldrijan, E. Taborska [et al.] // J. Dermatol. Sci. — 2001. — Vol.62, №1, — P. 22—35.

6. Burke M.D. 3-methylcholanthrene-induced monooxygenase (O-deethylation) activity of human lymphocytes / M.D. Burke, R.T. Mayer, R.E. Kouri // Cancer Res. — 1977. — Vol.37, №2. — P. 460—463.

7. Chelerythrine stimulates GSH transports by rat Mrp2 (Abcc2) expressed in canine kidney cells / H. Lou, M. Ookhhens, A. Stolz [et al.] // Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. — 2003. — Vol. 285. — P. G13335—G1344.

8. Colombo M.L. Pharmacological activities of Chelidonium Majus L (Papaveraceae) / M.L. Colombo, E. Bosisio // Pharmacol. Res. — Vol.33, №2. — P. 127—134.

9. Function of cytochrome P-450 of microsomes / T. Omura, R. Sato, D.Y. Cooper [et al.] // Fed. Proc. — 1965. — Vol. 24. — P. 1181—1187.

10. Habig W.H. Glutathione S-transferase. The first enzymatic step in mercapturic acid formation / W.H. Habig, M.J. Pabst, W.B. Jakoby // J. Biol. Chem. — 1974. -Vol.249, № 22. — P. 7130—7139.

11. Higgins G.M. Experimental pathology of the liver / G.M. Huggins, R.M. Anderson // Arch. Pathol. — 1931. —Vol. 12, №2. — P. 186—202.

12. Lane T. Chelerythrine inhibits the secretory response of human blood platelets without specifically inhibiting protein kinase C / T. Lane, P. Novales-Li // Tokai. J. Exp. Clin. Med. — 1996. — Vol.21, №2. — P. 61—67

13. Martins P.N.A. Rodent models of partial hepatectomies / P.N.A. Martins, T. P. Theruvath, P. Neuhans // Liver. International. — 2007. — Vol.28, №1. — P. 3—11.

14. Nash T. The colorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantzsch reaction / T. Nash // Biochem. J. — 1953. — Vol.55, №3. — P. 416—421.

15. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr [et al.] // J. Biol. Chem. — 1951. — Vol.193. — P. 265—275.

16. The microsomal monooxygenase system of regenerating liver / M.J.J. Ronis, C.K. Lumpkin, P.E. Thomas [et al.] // Biochem. Pharmacol. -1992. — Vol.43. — P. 567—573.

17. The plant alkaloid sanguinarine is a potential inhibitor of fol-licular angiogenesis / G. Basini, S.E. Santini, S. Bussolati [et al.] // Reprod. and develop. — 2007. — Vol.53, №3. — P. 573—579

18. Ulrichova J. Toxicology of quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids / J. Ulrichova // Biomed. Papers. — 2005. — Vol.149, Suppl.1. — P. 9—10.

19. Vascular endothelial growth factor and angiopoietins regulate sinusoidal regeneration and remodeling after partial hepatecto-my in rats / H. Shimizy, N. Mitsuhahashi, M. Ohtsura [et al.] // World. J. Gasrtoenterol. — 2005. — Vol.11, №46. — P. 7254—7260.

20. Zachary I. VEGF signaling: integration and multitasking in endothelial cell biology / I. Zachary // Biochem. Soc. Trans. — 2003. — Vol.31. — P. 1171—1177.

Надійшла до редакції 20.05.2011 р.