Особенности поведенческих реакций самок и самцов крыс при субхроническом воздействии 7-гидроксикумарина

  • Авторы: М.Л. Зиновьева, Н.О. Карпезо, О.В. Линчак
  • УДК: 615.9; 573.7:57.017.55; 591.111; 591.8
Скачать вложения:

1М.Л. Зінов'єва, наук.співр., 2Н.О. Карпезо, к.біол.н., 2О.В. Линчак, к.біол.н.

1Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, м. Київ,
2Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ

РЕЗЮМЕ. Исследованы поведенческие реакции крыс после воздействия различных доз 7-гидроксикумарина в течение трех месяцев и через месяц после прекращения его введения. Полученные данные показывают различия в поведенческих реакциях самок и самцов крыс после введения 7-гидроксикумарина. Изменения в поведении крыс в значительной степени зависят от дозы и длительности введения препарата. Самцы крыс оказались более чувствительными к действию 7-гидроксикумарина, но их нервная система быстрее восстанавливается после отмены препарата.
Ключевые слова: 7-гидроксикумарин, поведенческие реакции, нервная система.

Кумарин та його похідні є біологічно активними речовинами з широким спектром дії. Кумарини містяться в багатьох рослинах, що зумовлює їх наявність у харчових продуктах (спеціях, зеленому чаї), ефірних маслах (лавандовому, касієвому) та ін. Природні кумарини проявляють спазмолітичну, інсектицидну, бактерицидну і естрогенну дію [1]. 7-Гідроксикумарин, або умбеліферон, виявлений у складі екстрактів з лікарських рослин, має ліпазотропну [2], протизапальну, знеболюючу, імуномоделюючу активності [3, 4], що дозволяє розглядати його як потенційний засіб корекції патологічних станів.

Синтетичний 7-гідроксикумарин використовується також у легкій промисловості як оптичний відбілювач та ультрафіолетовий фільтр завдяки його здатності до інтенсивної флуоресценції.

Розширення сфери застосування даної сполуки вимагає оцінки безпечності її використання. Вивчено вплив 7-гідроксикумарину на морфо-функціональний стан печінки, нирок, кишечнику і міокарда щурів [5, 6]. Дослідження дії на нервову систему є одним з ключових моментів при аналізі токсичності хімічної речовини [7, 8]. Поведінкові реакції є чутливим показником, який дозволяє визначити наявність, ступінь і характер токсичного ураження нервової системи, визначити місце нейротоксичних ефектів у формуванні та розвитку токсичного процесу. Гістопатоморфологічний аналіз дозволяє глибше проаналізувати вплив досліджуваної речовини на нервову систему.

Метою даної роботи було вивчення впливу 7-гідроксикумарину на функціональний стан центральної нервової системи білих щурів при його субхронічному впливі.

Матеріали і методи досліджень

Досліди проведено на самцях і самках щурів з початковою масою 100-120 г (5 груп по 5 самців та 5 самок у групі). Щурів утримували при стандартному світловому дні на нормальному харчовому раціоні. Усі процедури з тваринами виконували з дотриманням міжнародних правил і норм біоетики [9].

7-гідроксикумарин (водна суспензія) вводили інтрагастрально за допомогою атравматичного зонду щоденно вранці до годування тварин у дозах 50 мг/кг, 200 мг/кг та 500 мг/кг (що складали 1/200, 1/50 і 1/20 ЛД50, відповідно) протягом трьох місяців. Контрольним тваринам у вищезазначений спосіб вводили воду. Проводили щоденний клінічний огляд тварин усіх груп з метою виявлення можливих симптомів інтоксикації, неврологічних порушень, таких як аномальна поведінка (стереотипія, задкування, зміна типових поведінко-вих патернів та ін.), порушення пози, координації рухів (атаксія та ін.), м'язового тонусу (ригідність м'язів, тремор, судоми) [10].

Раз на місяць досліджували поведінкові реакції щурів. Вивчали їх також через місяць після припинення введення 7-гідроксикумарину (відновний період) у групі тварин, що отримували препарат у дозі 500 мг/кг, та у контрольній групі.

Для вивчення можливих впливів 7-гідроксикумарину на поведінкові реакції було використано тест "Відкрите поле", запропонований Холлом [11]. Для цього тварин поміщають у велику квадратну камеру розміром 900х900 мм з пластмасовими чорними стінками висотою 500 мм. Підлогою є лист чорного пластику, поділений на 36 квадратів (150х150 мм). Виділяють периферичні, або зовнішні, квадрати (ті, що розміщені вздовж стінок) та центральні, або внутрішні, (ті, що не торкаються стінок). Освітлення камери — яскраве рівномірне.

Методика тестування полягає в тому, що щура висаджують у центр установки і спостерігають за його поведінкою 3 хвилини. При дослідженні поведінкових реакцій реєструють такі показники: кількість центральних та периферичних квадратів (окремо), які були перетнуті твариною — горизонтальна рухова активність або локомоція; піднімання на задні лапки (стійки) — вертикальна рухова активність, дослідницька активність; фризинг (завмирання на дію неспецифічного подразника — реакція пасивно-оборонного характеру); грумінг — емоційна активність; дефекація (болюси) та уринація характеризують рівень тривожності та вегетативні реакції щурів [12].

У кінці дослідження проводили макроскопічний огляд структур головного мозку, визначення його абсолютної та відносної маси, гістопатоморфологічне дослідження кори головного мозку. Для гістологічного аналізу шматочки мозку фіксували у рідині Буена, після стандартної гістологічної обробки заливали у парафін, робили зрізи товщиною 5-7 мкм та забарвлювали їх гематоксиліном-еозином-оранжем [13]. Морфо-функціональний стан тканин оцінювали, користуючись загальноприйнятими критеріями в патоморфології.

Статистична обробка результатів була проведена за критерієм Стьюдента. Для відповідних розрахунків використовували стандартний пакет програм статистичного аналізу Microsoft Excel 2007. Достовірною вважалась різниця, якщо значення р< 0,05.

Результати та їх обговорення

Надходження 7-гідроксикумарину протягом 3-х місяців у дозах 50-500 мг/кг не викликало клінічних симптомів інтоксикації, видимих ознак неврологічних порушень, проявів анормальної поведінки у тварин. Не було виявлено статистично достовірних змін абсолютної і відносної маси головного мозку тварин, змін його тканин за даними макроскопічного дослідження.

Гістопатологічний аналіз кори великих півкуль головного мозку щурів не виявив порушень цито- і мієлоархітектоніки кори після субхронічного впливу 7-гідроксикумарину в усьому діапазоні доз.

Дослідження в умовах "відкритого поля" показали, що після місяця впливу 7-гідроксикумарину зміни у поведінці відбуваються лише при дії максимальної дози у самців щурів. У них спостерігали достовірне зниження горизонтальної активності у внутрішніх квадратах на 62 %, зниження вертикальної активності, про що свідчить зменшення кількості зовнішніх стойок (на 47 %), а також вірогідне зростання кількості фризингів (майже в 3 рази) та уринацій (більше ніж удвічі). Інші показники залишаються без змін. У поведінці самок щурів змін під дією 7-гідроксикумарину протягом місяця не виявлено (табл. 1).

Таблиця 1

Зміни показників поведінкових реакцій щурів самців після впливу 7-гідроксикумарину протягом місяця

Такі зміни поведінкових реакцій після місяця впливу 7-гідроксикумарину свідчили про зниження загальної активності тварин (як моторної, так і дослідницької) та посилення стану емоційного дискомфорту — тривоги у відповідь на незнайоме оточення.

Після двох місяців впливу 7-гідроксикумарину у щурів обох статей відмічено зміни у поведінці. У самців щурів зростає кількість фризингів уже при дозі 200 мг/кг (більше ніж вдвічі) і ще більше (втричі) при максимальній дозі, більше ніж втричі зменшується тривалість грумінгу. Як і в попередній місяць, за дії препарату у дозі 500 мг/кг зменшується кількість зовнішніх стойок (більше ніж у 20 разів), крім того, зменшується кількість перетнутих зовнішніх квадратів (на 55 %). Активність тварин у центральній зоні не зазнавала статистично достовірних змін. Через два місяці впливу 7-гідроксикумарину з'являються зміни і у самок, але при дії його лише у максимальній дозі. У самок щурів знижується кількість перетнутих зовнішніх квадратів (на 50 %) і кількість зовнішніх стойок (більше ніж у 7 разів), а також зростає кількість фризингів (вдвічі) (табл. 2).

Таблиця 2

Зміни показників поведінкових реакцій щурів самців після впливу 7-гідроксикумарину протягом двох місяців

Таким чином, поведінка щурів після 2-х місяців впливу досліджуваної речовини характеризувалась дозозалежним посиленням пасивно-оборонної поведінки та загальним пригніченням активності щурів.

Через три місяці впливу 7-гідроксикумарину у поведінці самок і самців щурів відбуваються майже однакові зміни. Починаючи з дози 200 мг/кг, зростає кількість фризингів у тварин обох статей приблизно вдвічі, при цьому помітно збільшується їхня тривалість. Одночасно зменшується тривалість грумінгів, особливо суттєво у самців (у 2 рази при дії речовини в дозі 200 мг/кг і до мінімальних значень під впливом речовини в дозі 500 мг/кг). У самок зменшується кількість грумінгів лише при дії максимальної дози (у 3 рази).

У щурів при дії 7-гідроксикумарину у дозі 500 мг/кг істотно знижується вертикальна та горизонтальна активність. При цьому у самок знижується кількість перетнутих зовнішніх і внутрішніх квадратів (вдвічі), а у самців — тільки зовнішніх (у 5 разів). 7-гідроксикумарин у максимальній дозі призводить до зменшення кількості стойок, особливо суттєво у самців, у яких внутрішніх стойок зовсім не спостерігали, а кількість зовнішніх зменшувалась у 10 разів (табл. 3).

Таблиця 3

Зміни показників поведінкових реакцій самців щурів після впливу 7-гідроксикумарину протягом трьох місяців

Одержані дані свідчать, що за дії 7-гідроксикумарину протягом 3-х місяців у тварин обох статей відбувається значне пригнічення як рухової, так і дослідницької активності та значне посилення тривожного стану.

Відновлення поведінки після припинення введення 7-гідроксикумарину у самців щурів відбувається швидше, ніж у самок. Через місяць відновлення у них зміненим залишається лише один показник — кількість перетнутих зовнішніх квадратів (менше на 55 %). У самок залишаються зміненими такі показники як кількість перетнутих зовнішніх (менше на 48 %) і внутрішніх квадратів (менше на 46 %), зменшена кількість зовнішніх (втричі) і внутрішніх (майже в 10 разів) стойок, тривалість грумінгу (менше на 25 %) та кількість фризингів збільшена майже вдвічі (табл. 4). Отже, самці раніше починають реагувати на дію 7-гідроксикумарину, але й швидше відновлюються після припинення його дії.

Таблиця 4

Зміна показників поведінкових реакцій самців і самок щурів після місячного відновлення після впливу 7-гідроксикумарином протягом трьох місяців

Аналіз отриманих даних показав, що 7-гідроксикумарин у найменшій дозі (50 мг/кг) не чинить впливу на нервову систему щурів.

7-гідроксикумарин у дозі 200 мг/кг після двох місяців впливу викликає зміни у поведінці лише самців щурів. У них зростає кількість фризингів. Через три місяці впливу кількість фризингів зростає у самців і самок щурів, при цьому збільшується їх тривалість.

7-гідроксикумарин у дозі 500 мг/кг починає впливати на поведінкові реакції щурів вже через місяць після початку його введення. Так, у самців щурів знижується горизонтальна і вертикальна активність, а також вірогідно зростає кількість фризингів та уринація. Після двох місяців впливу 7-гідроксикумарину з'являються зміни у поведінці самок. У самців і у самок знижується кількість перетнутих зовнішніх квадратів і кількість зовнішніх стойок, а також зростає кількість фризингів. Через три місяці впливу 7-гідроксикумарину у поведінці самок і самців щурів відбуваються майже однакові зміни. У них зростає кількість і тривалість фризингів. Одночасно зменшується кількість грумінгів. Ці зміни є свідченням наростання у тварин рівня тривожності та невпевненості. У щурів істотно знижується вертикальна та горизонтальна активність, що є ознакою зниження їхньої пізнавальної активності.

Вплив 7-гідроксикумарину у дозах 200 і 500 мг/кг на поведінкові реакції щурів у "відкритому полі" характеризувався розбалансуванням показників психоемоційного стану щурів, пригніченням загальної рухової та дослідницької активності, посиленням поведінкових реакцій пасивно-оборонного характеру.

Через місяць після відміни 7-гідроксикума-рину відбувається значне відновлення поведінки щурів, при цьому спостерігають відмінності у відновному процесі між самцями та самками щурів. Повного відновлення поведінки за місяць не відбувається.

Одержані результати показали, що вплив 7-гідроксикумарину на поведінкові реакції щурів починається раніше у самців, ніж у самок, і у них раніше відбувається відновлення поведінки після відміни препарату, що може свідчити про більшу інертність вищої нервової діяльності самок за умов проведеного експерименту.

Висновки

1.  7-Гідроксикумарин при інтрагастральному введенні впродовж 3-х місяців у дозах 50-500 мг/кг не викликає симптомів інтоксикації; неврологічних порушень, (аномальної поведінки, порушення пози, координації рухів, м'язового тонусу); гістопатомор-фологічних змін у корі головного мозку.

2. Вплив 7-гідроксикумарину на нервову систему щурів характеризується зниженням вертикальної та горизонтальної рухової активності, що є ознакою пригнічення їхньої пізнавальної діяльності, зростанням кількості та тривалості фризингів та зменшенням тривалості грумінгів, що свідчить про порушення психоемоційного стану тварин, і є залежним від дози, тривалості введення та статі.

3. У щурів самців виявлені зміни поведінкових реакцій настають і відновлюються раніше, ніж у самок.

ЛІТЕРАТУРА

1. Орлов Ю.Е. Природные кумарины в биологии и медицине / Ю.Е. Орлов, К.Ф. Кулеш // Научно-технический прогресс в медицине и фундаментальных проблемах биологии: Тез. докл. — Х., 1987. — С. 285—286.

2. Янченко П.С. Виділення та вивчення деяких кумаринів і хромонів із рослин родин бобові та селерові та їх ліпазо-тропна активність / П.С. Янченко, А.М. Ковальова, Г.В. Георгіївський, А.М. Комісаренко // Фармаком. — 2004. — № 2. — С. 66—73.

3. Antinociceptive and anti-inflammatory properties of 7-hydroxycoumarin in experimental animal models: potential therapeutic for the control of inflammatory chronic pain / Т.А. Barros, L.A. de Freitas, J.M. Filho [et al.] // The Journal of pharmacy and pharmacology. — 2010. — № 2 (62). — P. 205—213.

4. Effects of umbelliferone in a murine model of allergic airway inflammation / J.F. Vasconcelos, M.M. Teixeira, J.M. Barbosa-Filho [et al.] // European Journal of Pharmacology -- 2009. -V. 609.- Issues 1-3. — P. 126—131.

5. Вплив 7-гідроксикумарину на морфологію печінки та тонкого кишечника щурів / Є.А. Сластья, Н.О. Карпезо, І.В. Харчук [та ін.] // Зб. наук. праць "Проблеми екологічної та медичної генетики і клітинної імунології" Київ-Луганськ-Харків. — 2007. — Вип. 3—4 (78—79). — С. 34—39.

6. Порівняльна характеристика біохімічних показників крові, сечі та морфо-функціонального стану внутрішніх органів самців та самок щурів за субхронічної дії 7-гідро-ксикумарину / О.М. Філінська, І.В. Харчук, С.В. Яблонська [та ін.] // Современные проблемы токсикологи. — 2010. — №4 (51). — С. 14—18.

7. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Д.П. Хьюстон. — М.: Медицина, 1991. — 399 с.

8. Богоявленська И.Ф. Особливості формування поведінкових реакцій під дією антропогенних забруднювачів в експерименті / И.Ф. Богоявленська // Современные проблемы токсикологи. — 2011. — №5(55). — С. 75—76.

9. Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. — Offical Journal of the European Communities , 1986. — L 358. — P. 1—29. — (EEC regulation).

10. Neurological Evaluation of Toxic Axonopathies in Rats: Acrylamide and 2,5-Hexanedione // R.M. LoPachin, J.F Ross, M.L. Reid [et al.] / Neuro Toxicology V. 23. — Iss. 1. — 2002. — P. 95—110.

11. Hall C.S. Emotional behavior in the rat. The relationship between emotionality and ambulatory activity / C.S. Hall // J. Comp. Physiol. Psychol. — 1936. — 122. — P. 345—352.

12. Аntoniadis E.A. Amygdala, hippocampus, and discriminative fear conditioning to context / E.A. Аntoniadis, R.J. McDonald // Behavioral Brain Research. — 2000. — № 108. — P. 1—19.

13. Волков О.В. Основы гистологии с гистологической техникой / О.В. Волков, Ю.К. Елецкий. — М.: Медицина, 1982. — 298 с.

 

REFERENCES

1. Orlov Yu.E. Prirodnye kumariny v biologii i medicine / Yu.E. Orlov, K.F. Kulesh // Nauchno-tekhnicheskij progress v medicine i fundamental'nykh problemakh biologii: Tez. dokl. — Kh., 1987. — S. 285—286.

2. Yanchenko P.S. Vydilennya ta vyvchennya deyakykh kumaryniv i khromoniv iz roslyn rodyn bobovi ta selerovi ta ikh lipazo-tropna aktyvnist' / P.S. Yanchenko, A.M. Koval'ova, G.V. Georgiivs'kyj, A.M. Komisarenko // Farmakom. — 2004. — № 2. — S. 66—73.

3. Antinociceptive and anti-inflammatory properties of 7-hydroxycoumarin in experimental animal models: potential therapeutic for the control of inflammatory chronic pain / Т.А. Barros, L.A. de Freitas, J.M. Filho [et al.] // The Journal of pharmacy and pharmacology. — 2010. — № 2 (62). — P. 205—213.

4. Effects of umbelliferone in a murine model of allergic airway inflammation / J.F. Vasconcelos, M.M. Teixeira, J.M. Barbosa-Filho [et al.] // European Journal of Pharmacology -- 2009. -V. 609.- Issues 1-3. — P. 126—131.

5. Vplyv 7-gidroksykumarynu na morfologiyu pechinky ta tonkogo kyshechnyka schuriv / E.A. Slast'ya, N.O. Karpezo, I.V. Kharchuk [ta in.] // Zb. nauk. prac' "Problemy ekologichnoi ta medychnoi genetyky i klitynnoi imunologii" Kyiv-Lugans'k-Kharkiv. — 2007. — Vyp. 3—4 (78—79). — S. 34—39.

6. Porivnyal'na kharakterystyka biokhimichnykh pokaznykiv krovi, sechi ta morfo-funkcional'nogo stanu vnutrishnikh organiv samciv ta samok schuriv za subkhronichnoi dii 7-gidro-ksykumarynu / O.M. Filins'ka, I.V. Kharchuk, S.V. Yablons'ka [ta in.] // Sovremennye problemy toksykology. — 2010. — №4 (51). — S. 14—18.

7. Buresh Ya. Metodiki i osnovnye eksperimenty po izucheniyu mozga i povedeniya / Ya. Buresh, O. Bureshova, D.P. Kh'yuston. — M.: Medicina, 1991. — 399 s.

8. Bogoyavlens'ka I.F. Osoblyvosti formuvannya povedinkovykh reakcij pid dieyu antropogennykh zabrudnyuvachiv v eksperymenti / I.F. Bogoyavlens'ka // Sovremennye problemy toksykology. — 2011. — №5(55). — S. 75—76.

9. Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. — Offical Journal of the European Communities , 1986. — L 358. — P. 1—29. — (EEC regulation).

10. Neurological Evaluation of Toxic Axonopathies in Rats: Acrylamide and 2,5-Hexanedione // R.M. LoPachin, J.F Ross, M.L. Reid [et al.] / Neuro Toxicology V. 23. — Iss. 1. — 2002. — P. 95—110.

11. Hall C.S. Emotional behavior in the rat. The relationship between emotionality and ambulatory activity / C.S. Hall // J. Comp. Physiol. Psychol. — 1936. — 122. — P. 345—352.

12. Аntoniadis E.A. Amygdala, hippocampus, and discriminative fear conditioning to context / E.A. Аntoniadis, R.J. McDonald // Behavioral Brain Research. — 2000. — № 108. — P. 1—19.

13. Volkov O.V. Osnovy gistologii s gistologicheskoj tekhnikoj / O.V. Volkov, Yu.K. Eleckij. — M.: Medicina, 1982. — 298 s.

 

Надійшла до редакції 07.05.2012 р.