Протягом останніх двох десятиріч особливу увагу в токсикології важких металів привертає транспорт важких металів у біосистемах, в першу чергу його клітинні ланки [1]. Серед ключових білків клітинного металотранспорту одне з провідних місць посідають металотіонеїни (МТ) [2, 3]. Цей транспортний білок відноситься до категорії не тільки найпоширеніших у тваринному і рослинному світі, а й міститься у представників видів, що мають різний історичний вік і знаходяться на різних еволюційних щаблях. Для членів сімейства металотіонеїнів характерне поєднання високого динамізму (адаптивності) з підвищеною стійкістю до зовнішніх впливів (термостабільність, здатність до зворотного окислення) [4]. Основна фізіологічна функція МТ полягає в транспорті цинку, забезпеченні його гомеостазу та біодоступності у місцях синтезу ключових ферментів. Завдяки наявності у складі МТ семи координаційних центрів, які здатні високоселективно зв’язувати іони d10 металів (Zn2+, Cd2+, Hg2+, Cu+, Ag+), МТ проявляє детоксикаційні властивості. Саме ці важкі метали є основними індукторами синтезу МТ [5].
Попри численні дослідження з проблеми М Т, залишаються не до кінця з’ясованими механізми його антитоксичної дії, недостатньо вивчені питання токсикокінетики та токсикодинаміки металокомплексів цього білка з кадмієм.
Мета роботи. Вивчення особливостей та порівняння токсикокінетики та токсикодинаміки CdCl2 та екзогенного комплексу кадмію з металотіонеїном при інтраперитонеальному введенні лабораторним мишам
Матеріали та методи
Експеримент проведено в лабораторії промислової та екологічної токсикології ДП «Український НДІ медицини транспорту». Лабораторних тварин одержували з віварію Одеського національного медичного університету, який обладнаний відповідно до існуючих санітарно-гігієнічних норм. Усіх дослідних тварин утримували в стандартних санітарних умовах при t = 20–24 °С, вологості 50–55 %, природному світловому режимі «день-ніч», на збалансованому харчовому раціоні відповідно до діючих норм. Усі дослідження відповідали правилам «Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та наукових цілей».
Дослідження проведені на статевозрілих безпородних мишах з вихідною масою 20-22 г. Для виділення МТ на першій стадії дослідження у щура вагою 300 г внутрішньочеревним (в/о) введенням хлориду кадмію в дозі 0,5 мг/кг (по солі) був викликаний індуктивний синтез МТ. За добу після введення CdCl2 тварину виводили з експерименту під хлороформним наркозом та виділяли печінку, яку гомогенізували в попередньо стерилізованій бідистильованій воді. З отриманого гомогенату виділяли низькомолекулярну білкову фракцію, що містить МТ, яку обробляли надлишком кадмію і витримували 1 годину для утворення комплексу Cd7-MT (тобто до повного насичення). Потім надлишок кадмію видаляли співосадженням з карбонатом кальцію. В результаті отримали розчин, що містить комплекс Cd7-MT. У аліквоті цього розчину визначили вміст кадмію, який становив 51,6 мкг/мл. Тварин утримували в стандартних умовах віварію з вільним доступом до їжі та води, що попередньо досліджувались на вміст ВМ. У жодному випадку вміст Zn, Cu, Hg, Cd не виходив за межі допустимих значень у харчових продуктах згідно з МБТ «Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов» [6] та ДсанПіН 2.2.4-171-10 "Гігієнічні вимоги до води питної, призначеної для споживання людиною" [7]).
Результати та їхнє обговорення
Для вивчення токсикокінетики і токсикодинаміки розподілу кадмію та синтезу МТ при одноразовому інтраперитонеальному введенні був проведений наступний експеримент. Білі миші масою 18-20 г були поділені на 2 групи по 18 тварин у кожній. Тваринам першої групи одноразово в/о вводили кадмій у вигляді CdCl2, другої – комплекс Cd7-MT в однаковій дозі 0,25 мг/кг по металу. Три інтактні миші служили контролем. Тварин виводили з експерименту через 1, 3, 6, 12, 24, 72, 120 годин з дотриманням правил біоетики. У тварин виділяли печінку і нирки. У зв'язку з малими масами органів пробу по 3 тваринах усереднювали. В отриманій пробі визначали вміст кадмію та МТ. Залежність накопичення кадмію та концентрація МТ в органах представлена на рис. 1.
Рис. 1. Динаміка зміни концентрації кадмію в нирках та печінці при одноразовому в/о введенні кадмію білим мишам у вигляді CdCl2 або Cd7-MT у однаковій дозі 0,25 мг/кг по металу
З рис. 1 видно, що вид кінетичної кривої розподілу кадмію в органах залежить від введеної сполуки. Дійсно, максимум вмісту кадмію в нирках при введенні Cd7-MT спостерігається значно раніше, ніж при введенні CdCl2. У печінці спостерігається протилежна картина. Але, вже через 72 години різниця в концентраціях зменшується і тенденція до згладжування відмінностей зберігається через 120 годин.
Якщо вміст металів у органах-мішенях при одноразовому введенні проходить через максимум і має тенденцію до досить швидкого зниження, то кінетика синтезу МТ має дещо іншу картину (рис. 2). Так, у нирках спостерігається досить швидке (вже через 6, а особливо 12 годин) зростання концентрації МТ при введенні Cd7-MT.
Рис. 2. Динаміка зміни концентрації МТ в нирках та печінці при одноразовому в/о введенні кадмію білим мишам у вигляді CdCl2 або Cd7-MT в одинаковій дозі 0,25 мг/кг по металу
На жаль, наш метод визначення МТ не дозволяє розрізнити екзогенний і ендогенний МТ. Але розрахунок матеріального балансу з урахуванням припущення, що практично весь введений Cd7-MT спрямовується для детоксикації в нирки, показує, що при цьому концентрація екзогенного МТ могла б досягати 32 нмоль/г. Однак навіть максимальна концентрація МТ у нирках незначно перевищує 20 нмоль/г, причому з цієї кількості слід відняти синтезований de novo у відповідь на надходження кадмію і присутній на базальному рівні М Т. Цей факт може свідчити про те, що поглинання комплексу Cd7-MT з крові відбувається досить повільно. Можливо, це є однією з причин аномально довгого терміну напіввиведення кадмію з організму.
У той же час, як видно з рис. 2, в печінці активний синтез МТ при введенні CdCl2 починається вже через 6 годин, досягаючи максимуму через 72 години.
У максимальній точці кінетичної кривої концентрація МТ перевищує первісну в 18,3 раза. Через 5 діб концентрація МТ у печінці незначно знижується, але зберігається на рівні 1640 % від вмісту МТ у печінці інтактних тварин. У той же час при введенні Cd7-MT зростання концентрації МТ у печінці менш виражене, але тенденція до зростання зберігається і через 5 діб після введення. Ймовірно, при введенні комплексу Cd7-MT, незважаючи на міцне зв'язування кадмію, частково відбувається перекомплексоутворення, а також розпад і деградація метало-білкового комплексу в лізосомах, що було показано нами в попередньому експерименті.
Оскільки раніше встановлено, що лізосомальний фермент КФ може бути маркером активації лізосом, вивчено кінетику зміни активності цього ферменту в нирках. Виявилося, що після одноразового в/о введення нефротоксичної дози кадмію 0,25 мг/кг, активність КФ у нирках проходить через максимум, причому положення цього максимуму залежить від сполуки кадмію. Так, вже через 6 годин після введення CdCl2 спостерігається активація лізосомального апарату і до 24 годин відбувається достовірне (порівняно з контролем) зростання активності КФ у печінці. Проте вже через 72 години спостерігається зниження активності КФ, яке триває і через 120 годин, досягаючи 79 % базального рівня. При веденні Cd7-MT у печінці зниження активності КФ з часом не спостерігається, а незначна (але достовірна порівняно з контролем) активація має місце через 72 години. У той же час у нирках через 24 години після введення зростає активність КФ, ймовірно, викликане активацією первинних лізосом і збільшенням їх числа. Найбільше зростання відбувається при введенні Cd7-MT (на 22% порівняно з контролем).
Рис. 3. Кинетика зміни активності кислої фосфатази в печінці та нирках після одноразового в/о введення кадмію білим мишам у вигляді CdCl2 або Cd7-MT в одинаковій дозі 0,25 мг/кг по металу.
Через 72 години відбувається зниження активності КФ, більш виражене при введенні CdCl2, ймовірно, за рахунок інгібування ферменту при утворенні металокомплексу з кадмієм в активному центрі та витіснення з нього цинку.
Таким чином, з проведених досліджень можна зробити наступні висновки:
1. Токсикокінетика та токсикодинаміка кадмію значно відрізняється при введенні неорганічної солі та екзогенного комплексу з металотіонеїном.
2. При введенні неорганічної солі максимальне зростання концентрації кадмію спостерігається в печінці, а при введенні комплексу Cd7-MT – в нирках.
3. Утворення комплексу Cdх-MT носить помітну гепатопротекторну дію.
4. Поглинання комплексу Cd7-MT з крові відбувається досить повільно. Можливо, це є однією з причин аномально тривалого періоду напіввиведення кадмію з організму.
5. З часом відбувається метаболізація сполук кадмію (зв’язування з транспортерами, розпад комплексів Cd7-MT у лізосомах з утворенням відносно низькомолекулярних сполук тощо), що дозволяє спостерігати зниження різниці в накопиченні та токсичній дії кадмію через 5 діб після його введення у вигляді різних сполук.
ЛІТЕРАТУРА
1. Общая токсикология// Под ред. Б.А.Курляндского, В.А.Филова – М. Медицина, 2002 – 608 с.
2. Foulkes E. C. // Transport of Heavy Metals by the Kidney / E. C. Foulkes // Toxicology Letters.– 1990. – V. 53, № 1–2 – Р. 29–31.
3. Пыхтеева Е. Г. Металлотионеин: биологические функции. Роль металлотионеина в транспорте металлов в организме / Е. Г. Пыхтеева // Актуальные проблемы транспортной медицины. – № 4 (18), 2009. — С. 44–58.
4. Шафран Л.М. Металлотионеины/Л.М. Шафран, Е.Г. Пыхтеева, Д.В. Большой / под редакцией проф. Л.М. Шафрана – Одесса: Издательство "Чорномор'я", 2011. – 428 с.
5. Curtis D. Klaassen. Induction of Metallothionein as an Adaptive Mechanism Affecting the Magnitude and Progression of Toxicological Injury / D. Curtis Klaassen and Jie Liu// Environmental Health Perspectives - 1998 - № 106, Suppl 1 – Р. 297–300.
6. Збірник важливих офіційних матеріалів з санітарних і протиепідемічних питань. Видання офіційне: в 6 т. [Під загальною редакцією Головного державного санітарного лікаря України В.Ф.Марієвського]. Т. 1. Частина 2. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. – Київ, 1995. – 246 с.
7. ДсанПіН 2.2.4-171-10 "Гігієнічні вимоги до води питної, призначеної для споживання людиною".
REFERENCES
1. Obschaya toksikologiya// Pod red. B.A.Kurlyandskogo, V.A.Filova – M. Medicina, 2002 – 608 s.
2. Foulkes E. C. // Transport of Heavy Metals by the Kidney / E. C. Foulkes // Toxicology Letters.– 1990. – V. 53, № 1–2 – Р. 29–31.
3. Pykhteeva E. G. Metallotionein: biologicheskie funkcii. Rol' metallotioneina v transporte metallov v organizme / E. G. Pykhteeva // Aktual'nye problemy transportnoj mediciny. – № 4 (18), 2009. — S. 44–58.
4. Shafran L.M. Metallotioneiny/L.M. Shafran, E.G. Pykhteeva, D.V. Bol'shoj / pod redakciej prof. L.M. Shafrana – Odessa: Izdatel'stvo "Chornomor'ya", 2011. – 428 s.
5. Curtis D. Klaassen. Induction of Metallothionein as an Adaptive Mechanism Affecting the Magnitude and Progression of Toxicological Injury / D. Curtis Klaassen and Jie Liu// Environmental Health Perspectives - 1998 - № 106, Suppl 1 – Р. 297–300.
6. Zbirnyk vazhlyvykh oficijnykh materialiv z sanitarnykh i protyepidemichnykh pytan'. Vydannya oficijne: v 6 t. [Pid zagal'noyu redakcieyu Golovnogo derzhavnogo sanitarnogo likarya Ukrainy V.F.Marievs'kogo]. T. 1. Chastyna 2. Medyko-byologycheskye trebovanyya y sanytarnye normy kachestva prodovol'stvennogo syr'ya y pyschevykh produktov. – Kyiv, 1995. – 246 s.
7. DsanPiN 2.2.4-171-10 "Gigienichni vymogy do vody pytnoi, pryznachenoi dlya spozhyvannya lyudynoyu".
Надійшла до редакції 1.07.2013 р.