Б.П. Кузьмінов¹, професор, доктор мед. наук, Д.Д. Остапів² старший наук, співробітник, доктор сільгосп.наук, Т.С. Зазуляк¹, старший наук, співробітник, кандидат біол. наук, В.А. Туркіна¹, старший наук, співробітник, кандидат біол. наук, Т.А. Микітчак³, старший наук, співробітник, кандидат біол. наук, O.I. Грушка¹

¹Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького
²Інститут біології тварин НААН
³Інститут екології Карпат НАН України

РЕЗЮМЕ. Проведено оцінку токсичності лікарського препарату L-лізину есцинату на гіллястовусих рачках Daphnia magna Straus та сперміях бугаїв. Встановлено, що токсичність L-лізину есцинату, яка призводить до смертності 50% гіллястовусих рачків Daphnia magna Straus, проявляється у межах З,7–18,7 мг/дм³, у залежності від часу дії та концентрації. Концентрація L-лізин-есцинату 15 мг/дм³ є слаботоксичною й належить до другого класу токсичності. Концентрація 30 мг/дм³ — помірно токсична, 3 клас токсичності.
L-лізину есцинат в дозах 1/250ЛД₅₀ та ЛД₅₀ чинить вплив на спермії бугаїв, який характеризується пониженою інтенсивністю окисних процесів, зниженим функціонуванням ланцюга дихання мітохондрій і ресинтезом АТФ, що зумовлює втрату рухливості та зменшення тривалості виживання.
Ключові слова: L-лізин есцинат, токсичність, альтернативні тест-об'єкти.

"L-лізину есцинат” (“L-lysine aescinat”, код АТС С05 СХ 03), новий вітчизняний лікарський препарат, який випускається корпорацією “Артеріум” на потужностях AT “Галичфарм” (м. Львів) [1]. Активнодіючою речовиною препарату є водорозчинна сіль есцину (суміші тритерпенових сапонінових глікозидів із плодів каштану кінського) та амінокислоти лізину [2]. L-лізину есцинат володіє протизапальною, протинабряковою та знеболюючою дією. Препарат призначають при посттравматичних, інтра- і післяопераційних набряках будь-якої локалізації, струсах мозку та при порушенні венозного кровообігу [3, 4, 5]. Промислове виробництво L-лізину есцинату обумовило проведення токсикологічної оцінки та обґрунтування допустимого рівня вмісту речовини в повітрі робочої зони [6].

За правилами нового європейського законодавства, яке набуло чинності з 2007 року, до переліку обов’язкових методів оцінки потенційної небезпечності хімічних речовин для здоров’я людини і довкілля повинні бути включені методи оцінки токсичності на альтернативних тест-об’єкгах [7].

Метою роботи була токсикологічна оцінка L-лізину есцинату на альтернативних тест-об’єктах — гіллястовусих рачках Daphnia magna Straus та сперміях бугаїв.

Матеріали та методи дослідження. L-лізин есцинат — порошок білого або злегка кремового кольору. Емпірична формула С₆₀Н₁₀₈К₂О₂₇.

Структурна формула:

Молекулярна маса препарату дорівнює 1288. Температура плавлення 227–233°С. Добре розчинний у воді та в оптовій кислоті, малорозчинний у метанолі та практично нерозчинний у 96 % етанолі та ефірах. Середньо-смертельна доза (ЛД₅₀) L-лізину есцинату при пероральному введенні для білих щурів-самців становить 815 мг/кг [6].

Оцінку токсичності L-лізину есцинату для гіллястовусих рачків Daphnia magna Straus (D. magna) проводили у відповідності з КНД 211.14.054-97 [8]. Критерієм токсичності препарату була загибель 50% і більше піддослідних тварин упродовж визначеного часу (через 1 год., 6 год., 24 год., 48 год., 72 год., та 96 год. проведення експерименту). Для порівняння токсичності різних концентрацій L-лізину есцинату (0,06 мг/дм³, 0,12 мг/дм³, 0,2 мг/дм³, 7,2 мг/дм³, 15 мг/дм³, 30 мг/дм³) використовували середню летальну концентрацію (JIK₅₀) за певний термін дії. Для кожної концентрації проведено по три паралельні досліди на виживання.

Перед проведенням дослідів визначали придатність культури дафній до біотестування за допомогою еталонної токсичної речовини — двохромовокислого калію (K₂Cr₂0₇). JIK₅₀ у цьому випадку становила 1,1 мг/дм³. Експериментально встановлений діапазон реагування тест-об’єкту D. magna коливається у межах 0,9–1,5 мг/дм³. Тобто культура була придатною для проведення біотестування. Всього у дослідах використано 180 особин D. magna віком до 24 год. та 30 особин у контрольному об’ємі. Дафній розсаджували по 10 особин у ємності зі 100 см³ води.

Для оцінки токсичності L-лізину есцинату на сперміях бугаїв використовували свіжоотримані еякуляти таких фізіологічних характеристик: об’єм 4–5 см³, концентрація сперміїв 0,7–0,9х10⁹ клітин/см³, кількість живих статевих клітин 70–85 %. Проби сперми ділили на контрольну розріджену фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) складу: NaCl — 0,8 г, КС1 — 0,02 г, Na₂HPО₄ — 0,11 г, КН₂РО₄ — 0,02 г, MgCl₂ — 0,01 г, Н₂О до 100 см³) та дослідні з додаванням у ФСБ L-лізину есцинату у дозах 1/250 ЛД₅₀ (3,36 мг) та ЛД₅₀ (815 мг). Визначали: виживання сперміїв (год.) до припинення прямолінійного поступального руху в збереженій при температурі 2–5 °С спермі, дихальну активність (ех tempore) — полярографічно (нг-атом 0/0,1 см³ сперми (С)Чхв) у термостатованій комірці (температура 38,5 °С) об’ємом 1,0 см³ з автоматичною реєстрацією перебігу процесу самопишучим потенціометром; відновну активність — потенціометрично (mV/0,1 см³ СЧхв) з використанням системи відкритих мікроелектродів, які вставляли в термостатовану полярографічну комірку [8]. Статистичний аналіз отриманого матеріалу проведено за М.О. Плохінським [9].

Результати досліджень та їх обговорення.

Динаміка загибелі D. magna упродовж біотестування L-лізину есцинату наведена у табл. 1.

Таблиця 1.
Динаміка загибелі D. magna упродовж біотестувашія L-лізину есцинату

Смертність обраховано за співвідношенням загиблих особин у досліді до загиблих особин у контролі. Встановлено, що в порівнянні з контролем, порогова смертність особин дафній проявляється в концентраціях від 0,12 до 0,2 мг/дм³. Проте у цьому випадку смертність особин є невисокою (7% за 96 год.) і не достовірно відрізняється від рівня смертності у контролі (0% за 96 год.), вказуючи на низьку токсичну дію. Достовірна різниця між смертністю особин в експерименті (33%) й контролі (0%) відзначена після 24 год. дії препарату в концентрації 30 мг/дм³ (табл. 2).

Таблиця 2. Смертність особин D. magna відносно контролю (%)

За часом проведення експерименту та смертністю 50% особин і більше встановлено, що концентрація L-лізину есцинату 15 мг/дм³ є слаботоксичною й належить до другого класу токсичності; концентрація 30 мг/дм³ — помірно токсична, 3 клас токсичності. Менші концентрації не є токсичними чи мають статистично непідтверджену опосередковану дію на життєвість дафній.

Показники смертності було переведено у статистичні пробітні величини (пробіти), а концентрації речовини — у їхній десятковий логарифм, при цьому використовувалися показники смертності, більші за нуль і менші за 100%. За пробітами та десятковим логарифмом концентрацій побудовано графіки (рис. 1–3) для розрахунку JIK₅₀ за антилогарифмом концентрації до пробіти зі значенням 5. Також визначено середнє квадратичне відхилення (а) ЛК₅₀ за трьома повторностями кожного досліду.

Рис. 1. Графік для розрахунку летальної концентрації L-лізину есцинату — 48 год. (пробіті 5 відповідає lg10 1,22); ЛК₅₀ за антилогарифмом дорівнює 16,6 мг/дм³

<./p>

Рис. 2. Графік для розрахунку летальної концентрації L-лізину есцинату — 72 год. (пробіті 5 відповідає lg10 1,07); ЛК₅₀ за антилогарифмом дорівнює 11,8 мг/дм³

Рис. 3. Графік для розрахунку летальної концентрації — 96 год. (пробіті 5 відповідає lg10 0,92); ЛК₅₀ за антилогарифмом дорівнює 8,3 мг/дм³

Виявлено, що ЛК₅₀ 48 год. становить 16,6±2,1 мг/дм³, JIK₅₀ 72 год. — 11,8±0,8 мг/дм³, ЛК₅₀ 96 год. — 8,3±4,6 мг/дм³. З урахуванням відхилення середнього квадратичного (а), токсичність препарату, яка призводить до смертності 50% тест-об’єктів, проявляється у межах 3,7–18,7 мг/дм³ і залежно від часу дії та концентрації.

Таким чином, встановлено, що L-лізину есцинат впливає на життєздатність особин D. magna прямопропорційно до збільшення його концентрацій та часу дії на ювенільні особини (рис. 4), тобто за умови тривалої дії препарату і більшої його концентрації, зростає відсоток смертності тест-об’єктів.

Рис. 4. Залежність ЛК₅₀ L-лізину есцинату від часу дії речовини

L-лізину есцинат з подібним ефектом викликає негативні зміни у функціонуванні різних особин дафній, оскільки найбільша різниця між кількістю живих і загиблих дафній у паралельних дослідах з однаковими концентраціями сягала лише трьох особин. Тобто при тривалій дії препарату смертність особин істотніше відрізняється у ємностях з однаковими концентраціями, ніж за його короткотривалої порогової дії.

Результати проведеного експерименту є статистично достовірними, оскільки в контролі не загинула жодна особина, а смертність в експериментальних ємностях перевищила 50%.

Виживання сперміїв у спермі за дії L-лізину есцинату було понижене. При цьому, препарат в дозі 1/250 ЛД₅₀ на 5,6 % знижував виживання сперміїв, а на рівні ЛД₅₀ L-лізину есцинату зниження досягало 16,7%, порівняно з контролем (табл. 3). Вплив застосованих доз L-лізину есцинату на виживання сперміїв був слабкий за силою (h²= 0,064).

Більшими змінами характеризувалися показники дихальної та відновної активностей сперми за впливу препарату. Так, інтенсивність споживання кисню спермою за додавання L-лізину есцинату знижувалася на 40,6% за дози 1/250 ЛД₅₀ і на 75,7% за дози ЛД₅₀, в порівнянні з контролем. Гальмування дихальної активності супроводжувалося зменшенням транспорту протонів і електронів зі сперміїв в позаклітинне середовище, що проявлялось зниженням відновної активності за дози 1/250 ЛД₅₀ L-лізину есцинату на 86,0 % і за ЛД₅₀ — на 76,0 % (р < 0,05). Вплив наростаючих доз L-лізину есцинату на дихальну і відновну активність сперми був відповідно середнім за силою (h²=0,427) та сильним (h²=0,709).

Таблиця 3.
Виживання сперміїв та інтенсивність окисних процесів у спермі бугаїв за дії L-лізину есінат, п=3; М±m

Висновки

1. Токсичність L-лізину есцинату, яка призводить до смертності 50% гіллястовусих рачків Daphnia magna Straus, проявляється у межах 3,7–18,7 мг/дм², у залежності від часу дії та концентрації. Концентрація L-лізину есцинату 15 мг/дм³ є слаботоксичною й належить до другого класу токсичності. Концентрація L-лізину есцинату 30 мг/дм³ — помірно токсична, З клас токсичності.

2. L-лізину есцинат в дозах 1/250 ЛД₅₀ та ЛД₅₀ чинить вплив на спермії бугаїв, який характеризується пониженою інтенсивністю окисних процесів, ймовірно, зниженим функціонуванням ланцюга дихання мітохондрій і ресинтезом АТФ, що зумовлює втрату рухливості та зменшення тривалості виживання.

ЛІТЕРАТУРА

1. Шовковий А.В. Розробка методів аналізу нових біологічно активних сполук у ряду похідних амінокислот для стандартизації лікарських засобів на їх основі: автореф. дис. на здобуття наук.ступеня канд. фарм. наук: спец.15.00.03 “Стандартизація та організація виробництва лікарських засобів” / А.В.Шовковий. — Харків, 1999. — 28 с.

2. Куцик Р.В. Каштан конський (Aesculus hippocastanum L.) / Р.В. Куцик, Б.М. Зузук, В.В. Дьячок // Провізор. — 2002. — №5. — С. 36–40.

3. Поворознюк В.В. Использование L-лизина эсцината в реабилитации больных с остеохондрозом пояснично-крестцового отдела позвоночника / В.В. Поворознюк, О.Б. Шеремет // Вісник ортопедії, травматології та протезування. — 2003. — №3. — С. 25–29.

4. Спасиченко П.В. Лечение больных с тяжелой черепно-мозговой травмой с применением L-лизина эсцината / П.В. Спасиченко // Український нейрохірургічний журнал. — 2003. — №4 (24). — С. 33–41.

5. Сапон НА. Применение препарата L-лизина эсцинат в нейрохирургии, неврологии, травматологии и ортопедии / Н.А. Сапон, П.В.Спасиченко // Новости медицины и фармации. — 2004. — № 10–11(150–151). — С. 3–5.

6. Кузшінов Б.П. Обгрунтування орієнтовно безпечного рівня впливу L-лізину есцинату у повітрі робочої зони / Б.П. Кузьмінов, О.І. Грушка, Т.С. Зазуляк // Вестник гигиены и эпидемиологии. — 2009. — Том 13. — №1. — С. 143–146.

7. Профілактична токсикологія та медична екологія. Вибрані лекції для науковців, лікарів та студентів за загальною редакцією академіка НАМИ України І.М. Трахтенберга. К.: ВД “АВІЦЕНА”, 2011. — 320 с.

8. Плохинский Н.А. Биометрия 2-е изд. / Н.А. Плохинский. — М.: Изд-во МГУ, 1970. — 367 с.

9. Штольц К.Ф. Амперометрическое определение ферроцианада в присутствии субклеточных структур / К.Ф. Штольц, И.М. Мосолова, JI.A. Дронова // Биохимические методы. — М.: Наука, 1980. — С. 147–150.

REFERENCES

1. Shovkovyj A.V. Rozrobka metodiv analizu novykh biolohichno aktyvnykh spoluk u ryadu pokhidnykh aminokyslot dlya standartyzacii likars'kykh zasobiv na ikh osnovi: avtoref. dys. na zdobuttya nauk.stupenya kand. farm. nauk: spec.15.00.03 “Standartyzaciya ta orhanizaciya vyrobnyctva likars'kykh zasobiv” / A.V.Shovkovyj. — Kharkiv, 1999. — 28 s.

2. Kucyk R.V. Kashtan kons'kyj (Aesculus hippocastanum L.) / R.V. Kucyk, B.M. Zuzuk, V.V. D'yachok // Provizor. — 2002. — №5. — S. 36–40.

3. Povoroznyuk V.V. Ispol'zovanie L-lizina escinata v reabilitacii bol'nykh s osteokhondrozom poyasnichno-krestcovogo otdela pozvonochnika / V.V. Povoroznyuk, O.B. Sheremet // Visnyk ortopedii, travmatolohii ta protezuvannya. — 2003. — №3. — S. 25–29.

4. Spasichenko P.V. Lechenie bol'nykh s tyazheloj cherepno-mozgovoj travmoj s primeneniem L-lizina escinata / P.V. Spasichenko // Ukrains'kyj nejrokhirurhichnyj zhurnal. — 2003. — №4 (24). — S. 33–41.

5. Sapon NA. Primenenie preparata L-lizina escinat v nejrokhirurgii, nevrologii, travmatologii i ortopedii / N.A. Sapon, P.V.Spasichenko // Novosti mediciny i farmacii. — 2004. — № 10–11(150–151). — S. 3–5.

6. Kuzshinov B.P. Obhruntuvannya oriyentovno bezpechnoho rivnya vplyvu L-lizynu escynatu u povitri robochoi zony / B.P. Kuz'minov, O.I. Hrushka, T.S. Zazulyak // Vestnik gigieny i epidemiologii. — 2009. — Tom 13. — №1. — S. 143–146.

7. Profilaktychna toksykolohiya ta medychna ekolohiya. Vybrani lekcii dlya naukovciv, likariv ta studentiv za zahal'noyu redakciyeyu akademika NAMY Ukrainy I.M. Trakhtenberha. K.: VD “AVICENA”, 2011. — 320 s.

8. Plokhinskij N.A. Biometriya 2-e izd. / N.A. Plokhinskij. — M.: Izd-vo MGU, 1970. — 367 s.

9. Shtol'c K.F. Amperometricheskoe opredelenie ferrocianada v prisutstvii subkletochnykh struktur / K.F. Shtol'c, I.M. Mosolova, JI.A. Dronova // Biokhimicheskie metody. — M.: Nauka, 1980. — S. 147–150.

Надійшла до редакції 19.08.2014 p.