Фармпрепарати на базі гентаміцину сульфату нині широко використовуються у світовій лікарській практиці. Це обумовлено активною бактеріостатичною дією гентаміцину сульфату щодо багатьох грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів, низькою здатністю до розвитку резистентності [1, 2]. Вітчизняними виробниками таких препаратів є АТ "Галичфарм" (Львів), ЗАТ "Фармацевтична фірма "Дарниця" (Київ), ТОВ "Фармацевтична компанія "Здоров'я" (Харків) та ін. В умовах виробництва гентаміцину сульфат може знаходитись у повітрі у вигляді аерозолю дезінтеграції та спричиняти негативний вплив на здоров'я робітників [3, 4]. Гранично допустима концентрація (ГДК) гентаміцину (гентаміцину-основи та гентаміцину-сульфату) у повітрі робочої зони становить 0,05 мг/м3, І клас небезпеки [5]. Масову концентрацію гентаміцину сульфату в повітрі робочої зони визначають за допомогою методики, яка не конкретизує хімічну форму гентаміцину [6]. Це може призводити до значних похибок при проведенні вимірювання та неточностей одержаних результатів.
Мета роботи: розробка методики вимірювання масової концентрації гентаміцину сульфату в повітрі робочої зони, яка виконується у відповідності з сучасними вимогами до метрологічних характеристик методик та забезпечує визначення речовини на рівні половини значення ГДК.
Об'єкти та методи досліджень. Дослідження проводились шляхом вивчення фізико-хімічних властивостей гентаміцину сульфату, підбору аналітичного методу визначення речовини, побудови градуювальної залежності аналітичного сигналу від маси речовини у розчині, а також встановлення характеристик похибки вимірювання і нормативів контролю у відповідності з ГОСТ 12.1.005-88, ГОСТ 8.10-99, ГОСТ 12.1.016-79, ДСТУ ГОСТ ИСО 5725-2:2005, ДСТУ-Н РМГ 61:2006 [7-11].
Результати та їх обговорення. Гентаміцину сульфат (Gentamycini sulfas) — антибіотик-аміноглікозид, продукується Micromonospora purpurea. Агрегатний стан — аморфний порошок білого або злегка кремового кольору. Відносна молекулярна маса гентаміцину сульфату (Мr) — 575,67, емпірична формула — С21H45N5O11S. Хімічна назва сполуки — 2-[4,6-діаміно-3-[3-аміно-6-(1-метиламіноетил)oксaн-2-іл]окси-2-гідрокси — циклогексокси] -5 -метил-4-метиламінооксан -3,5-діолсульфат. Реєстраційні номери — CAS 1405-41-0, EINECS 215-778-9. Речовина добре розчинна у воді, практично нерозчинна в 96 % етанолі та органічних розчинниках [12, 13].
При розробці методики використано здатність аміногруп молекули антибіотика взаємодіяти з ацетилацетоном та формальдегідом з утворенням сполуки жовтого кольору з подальшим спектрофотометричним визначенням оптичної густини отриманих розчинів [6, 13]. Відбір проб проводили з концентруванням речовини на фільтр АФА-ВП-20. Обчислення масової концентрації гентаміцину сульфату здійснювали за градуювальною залежністю величини оптичної густини від маси речовини у градуювальних розчинах.
Методика забезпечує виконання вимірювань масової концентрації гентаміцину сульфату в повітрі робочої зони в діапазоні від 0,025 мг/м3 до 0,100 мг/м3. Межа виявлення гентаміцину сульфату в об'ємі проби, який аналізується, — 10 мкг. Нижня межа вимірювання масової концентрації гентаміцину сульфату в повітрі робочої зони (при відборі 480 дм3 повітря) — 0,025 мг/м3.
Математична обробка отриманих результатів показала, що границі сумарної відносної похибки (± δ) в умовах однієї лабораторії при Р = 0,95 не перевищують 25 %. Значення нормативів оперативного контролю при Р = 0,95 та n = 2, наступні: збіжніть (d) — 8 %; відтворюваність (D) — 15 %; похибка вимірювання (К) — 17 %.
Оптичну густину розчинів вимірювали за допомогою спектрофотометра СФ 46 при довжині хвилі 325 нм та довжині оптичного шляху кварцової кювети — 10 мм.
Реактив для проведення кольорової реакції (реактив С) отримується безпосередньо перед проведенням вимірювання. Для цього у мірний циліндр місткістю 150 см3 вносять 50 см3 буферної суміші з pH 2,56, 4,0 см3 ацетил-ацетону, 10,0 см3 водного розчину формальдегіду з масовою часткою речовини 30 %, перемішують, доводять до 150 см3 буферною сумішшю. Буферну суміш з pH 2,56 готують змішуванням реактиву А та реактиву Б. Приготування реактиву А: наважку (22,530 0,001) г ортофосфорної кислоти з масовою часткою основної речовини 87 % поміщають у хімічний стакан місткістю 100 см3, у який попередньо внесено приблизно 50 см3 дистильованої води, і перемішують. Аналогічно розчиняють наважку (12,000 0,001) г льодяної оцтової кислоти та наважку борної кислоти масою (12,360 0,001) г. Отримані розчини переносять у мірну колбу на 1000 см3, в яку попередньо внесено від 200 см3 до 300 см3 дистильованої води, та доводять вміст колби до мітки дистильованою водою. Реактив Б — розчин натрію гідроксиду з молярною концентрацією 1 моль/дм3. Далі змішують 1000 см3реактиву А та 150 см3 реактиву Б, відміряного за допомогою мірного циліндра. Значення pH вимірюють потенціометрично.
Градуювальні розчини готують з гентаміцину сульфату, який відповідає вимогам Держфармакопеї України з вмістом активної речовини 85 %. При цьому масова концентрація основного градуювального розчину становить 1000 мкг/см3, робочого градуювального розчину — 20 мкг/см3. Шкала градуювальних розчинів — згідно з табл. 1.
Таблиця 1
Шкала градуювальних розчинів
У всі пробірки з градуювальними розчинами додають по 2,5 см3 реактиву С, перемішують та кип'ятять на водяній бані упродовж 15 хв. Пробірки з отриманими розчинами охолоджують, доводять об'єми розчинів дистильованою водою до 5 см3, знову перемішують і вимірюють оптичну густину відносно розчину порівняння (розчин № 1 в таблиці 1). Будують градуювальний графік залежності оптичної густини розчину (вісь ординат) від маси речовини у мікрограмах (вісь абсцис). Для встановлення градуювальної залежності отримані результати обробляють за методом найменших квадратів, визначаючи коефіцієнти а та b лінійної градуювальної функції згідно з ДСТУ ISO 8466-1 [14]. Градуювальну залежність записують рівнянням (1):
D325 = a + bmгр. (1)
де D325 — оптична густина розчину, що спектрофотометрується, mгр — маса гентаміцину сульфату у відповідному градуювальному розчині, мкг; а — масштабний коефіцієнт, що дорівнює довжині відрізка, який відсікає градуювальна пряма на осі ординат; b — коефіцієнт регресії, який дорівнює тангенсу кута нахилу градуювальної прямої.
Отримана градуювальна залежність описується рівнянням (2):
D = 0,005152mгр.+ 0,000959 (2).
Градуювальна залежність оптичної густини розчинів від кількості гентаміцину сульфату наведена на рис. 1.
Рис. 1. Градуювальна залежність оптичної густини розчину від вмісту гентаміцину сульфату
Для вимірювання концентрації гентаміцину сульфату у повітрі робочої зони проби повітря протягують крізь фільтр АФА-ВП-20 за допомогою аспіраційного пристрою з об'ємною витратою 20,0 дм3/хв упродовж 24 хвилин. Фільтр з відібраною пробою за допомогою пінцета поміщають у стакан місткістю 25 см3, додають для екстрагування речовини 3 см3 здистильованої води і залишають на 10 хв., періодично перемішуючи скляною паличкою. Далі за допомогою піпетки відбирають 2,5 см3 отриманого екстракту, переносять у мірну пробірку місткістю 10 см3 та обробляють аналогічно з градуювальними розчинами. Розчин порівняння готують, обробляючи чистий фільтр АФА-ВП-20 одночасно та аналогічно з пробою. Отримані розчини переносять у спектрофотометричні кювети і проводять спектрофотометричне вимірювання.
Масову концентрацію гентаміцину сульфату ρі, мг/м3 (і = 1,2) для кожної з паралельних проб повітря обчислюють за формулами 3 та 4:
де mі — маса гентаміцину сульфату в об'ємі проби, який аналізується, знайдена за градуювальним графіком, мкг; D325і — оптична густина розчину і-тої паралельної проби; а та b -коефіцієнти градуювальної залежності; V20 — об'єм відібраного повітря, приведений до нормальних умов, дм3; V1 — загальний об'єм екстракту, який отримано після обробки фільтра, см3; V2 — об'єм екстракту, який отримано після обробки фільтра взятого для аналізу, см3.
Проводять контроль збіжності результатів визначень масової концентрації гентаміцину сульфату. Якщо результати контролю збіжності задовільні, то за результат вимірювань масової концентрації гентаміцину сульфату в повітрі робочої зони ρГМ мг/м3 , приймають середнє значення, з двох результатів визначень ρ1 та ρ2. Результат вимірювання заокруглюють і записують до другої значущої цифри та подають у вигляді:
(ρГМ), мг/м3±δ, %, P = 0,95.
Висновок
Розроблено методику вимірювання масової концентрації гентаміцину сульфату у повітрі робочої зони. За своїми метрологічними характеристиками методика відповідає вимогам ГОСТ 8.10-99, ГОСТ 12.1.016-79, ГОСТ 12.1.005-88 і забезпечує визначення речовини на рівні половини значення ГДК (Свідоцтво Укрметртестстандарту про атестацію МВВ № 081/12-0475-07 від 28.11.2007 р.).
ЛІТЕРАТУРА
1. Решедько Г.К. Механизмы резистентности к аминогликозидам у нозокомиальных грамотрицательных бактерий в России: результаты многоцентрового исследования // Г.К. Решедько // Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия. — М., 2001. — Т.3. — № 2. — С. 111—125.
2. Halstead Diane. In Vitro Bactericidal Activities of Gentamicin, Cefazolin, and Imipenem in Peritoneal Dialysis Fluids // Diane Halstead, Jozef Guzzo, James Giardina, Andrea Geshan / Antimicrobial Agents and chemotherapy/ — American Society for Microbiology/ — 1989. — Vol. 33, No. 9/ — p. 1553—1556/
3. Amdisen A. Побочные действия лекарственных средств / А. Amdisen, Scho u M.; под. ред. М.Н. Дюкса; [пер. с англ.] — М., 1983. — 506 с.
4. Лакин К.М. Биотрансформация лекарственных веществ / К.М. Лакин, Ю.Ф. Крылов. — М.: Медицина, 1981. — 344 с.
5. Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Дополнение № 5 к списку ПДК, утв. МОЗ СССР № 4617-88: № 5201-90, утв. 05.12.1990 г. — М., 1990. — 9 с.
6. Методические указания по фотометрическому измерению концентраций гентамицина в воздухе рабочей зоны: МУ № 5951-91. — утв. 10.10.91 г. — М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора Российской федерации, 1993. — C. 38—40.
7. ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны: ГОСТ 12.1.005-88. — Введ. 01.01.89. — М.: Изд-во стандартов, 1988. — 48 с.
8. Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений. Основные положения: ГОСТ 8.010-99. — Введ. 01.06.2001 г. — К: Госстандарт Украины, 2002. — 23 с.
9. Воздух рабочей зоны. Требования к методикам измерения концентраций вредных веществ: ГОСТ 12.1.016-79. — Введ. 01.01.82 . — М.: Изд-во стандартов, 1979. — 10 с.
10. Точність (правильність і прецизійність) методів та результатів вимірювання. Частина 2. Основний метод визначення повторюваності і відтворюваності стандартного методу вимірювання (ГОСТ ИСО 5725-2-2003, IDT): ДСТУ ГОСТ ИСО 5725-2:2005. — Введ. 01.07.2006 р. — К.: Держспоживстандарт України, 2006. — 59 с.
11. Метрологія. Показники точності, правильності, прецизійності методик кількісного хімічного аналізу. Методи оцінення (РМГ 61-2003, IDT): ДСТУ-Н РМГ 61:2006. — Введ. 01.07.2007 р. — К.: Держспоживстандарт України, 2007. — 41 с.
12. Державна Фармакопея України / Державне підприємство "Науково-експертний фармакопейний центр". — 1-е вид. — Доповнення 2. — Харків: Державне підприємство "Науково-експертний фармакопейний центр", 2008. — С. 399-402.
13. Эллиот Д. Справочник биохимика / Эллиот Д., Джонс Д., Досон Р. — М.: Мир, 1991. — 540 с.
14. Якість води. Визначання градуювальної характеристики методик кількісного хімічного аналізу. Частина 1. Статистичне оцінювання лінійної градуювальної характеристики (ISO 8466-1:1990, IDT): ДСТУ ISO 8466-1-2001. — Введ. 01.01.2003 р. — К.: Держстандарт України, 2002. — 13 с.
REFERENCES
1. Reshed'ko G.K. Mekhanizmy rezistentnosti k aminoglikozidam u nozokomial'nykh gramotricatel'nykh bakterij v Rossii: rezul'taty mnogocentrovogo issledovaniya // G.K. Reshed'ko // Klinicheskaya Mikrobiologiya i Antimikrobnaya Khimioterapiya. — M., 2001. — T.3. — № 2. — S. 111—125.
2. Halstead Diane. In Vitro Bactericidal Activities of Gentamicin, Cefazolin, and Imipenem in Peritoneal Dialysis Fluids // Diane Halstead, Jozef Guzzo, James Giardina, Andrea Geshan / Antimicrobial Agents and chemotherapy/ — American Society for Microbiology/ — 1989. — Vol. 33, No. 9/ — p. 1553—1556/
3. Amdisen A. Pobochnye dejstviya lekarstvennykh sredstv / A. Amdisen, Scho u M.; pod. red. M.N. Dyuksa; [per. s angl.] — M., 1983. — 506 s.
4. Lakin K.M. Biotransformaciya lekarstvennykh veschestv / K.M. Lakin, Yu.F. Krylov. — M.: Medicina, 1981. — 344 s.
5. Predel'no-dopustimye koncentracii (PDK) vrednykh veschestv v vozdukhe rabochej zony. Dopolnenie № 5 k spisku PDK, utv. MOZ SSSR № 4617-88: № 5201-90, utv. 05.12.1990 g. — M., 1990. — 9 s.
6. Metodicheskie ukazaniya po fotometricheskomu izmereniyu koncentracij gentamicina v vozdukhe rabochej zony: MU № 5951-91. — utv. 10.10.91 g. — M.: Informacionno-izdatel'skij centr Goskomsanepidnadzora Rossijskoj federacii, 1993. — C. 38—40.
7. SSBT. Obschie sanitarno-gigienicheskie trebovaniya k vozdukhu rabochej zony: GOST 12.1.005-88. — Vved. 01.01.89. — M.: Izd-vo standartov, 1988. — 48 s.
8. Gosudarstvennaya sistema obespecheniya edinstva izmerenij. Metodiki vypolneniya izmerenij. Osnovnye polozheniya: GOST 8.010-99. — Vved. 01.06.2001 g. — K: Gosstandart Ukrainy, 2002. — 23 s.
9. Vozdukh rabochej zony. Trebovaniya k metodikam izmereniya koncentracij vrednykh veschestv: GOST 12.1.016-79. — Vved. 01.01.82 . — M.: Izd-vo standartov, 1979. — 10 s.
10. Tochnist' (pravyl'nist' i precyzijnist') metodiv ta rezul'tativ vymiryuvannya. Chastyna 2. Osnovnyj metod vyznachennya povtoryuvanosti i vidtvoryuvanosti standartnoho metodu vymiryuvannya (HOST ISO 5725-2-2003, IDT): DSTU HOST ISO 5725-2:2005. — Vved. 01.07.2006 r. — K.: Derzhspozhyvstandart Ukrainy, 2006. — 59 s.
11. Metrolohiya. Pokaznyky tochnosti, pravyl'nosti, precyzijnosti metodyk kil'kisnoho khimichnoho analizu. Metody ocinennya (RMH 61-2003, IDT): DSTU-N RMH 61:2006. — Vved. 01.07.2007 r. — K.: Derzhspozhyvstandart Ukrainy, 2007. — 41 s.
12. Derzhavna Farmakopeya Ukrainy / Derzhavne pidpryemstvo "Naukovo-ekspertnyj farmakopejnyj centr". — 1-e vyd. — Dopovnennya 2. — Kharkiv: Derzhavne pidpryemstvo "Naukovo-ekspertnyj farmakopejnyj centr", 2008. — S. 399-402.
13. Elliot D. Spravochnik biokhimika / Elliot D., Dzhons D., Doson R. — M.: Mir, 1991. — 540 s.
14. Yakist' vody. Vyznachannya hraduyuval'noi kharakterystyky metodyk kil'kisnoho khimichnoho analizu. Chastyna 1. Statystychne ocinyuvannya linijnoi hraduyuval'noi kharakterystyky (ISO 8466-1:1990, IDT): DSTU ISO 8466-1-2001. — Vved. 01.01.2003 r. — K.: Derzhstandart Ukrainy, 2002. — 13 s.
Надійшла до редакції 11.07.2011 р.