Полученные результаты по токсическому действию озона на бактерии Escherichia coli [1-3] являются основанием для проведения дальнейших экспериментов по изучению токсико-инактивирующего действия озона на другие таксономические группы микроорганизмов в различных растворах.
В представленной статье приведены данные по изучению токсических свойств озона по отношению к таким микроорганизмам: Staphylococcus aureus, дрожжеподобным грибам Candida albicans и споровым формам Bacillus subtilis [4, 7, 14].
Материалы и методы
Для исследований использовали культуры бактерий Staphylococcus aureus, штамм 209, полученные из коллекции Харьковского института иммунологии, вакцин и сывороток АМН Украины. Bacillus subtilis АТСС 6633 и дрожжеподобные грибы Candida albicans АТСС 835-653 (2 последних штамма получены из коллекции АОЗТ "Здоровье").
Эксперименты с указанными микроорганизмами проводили согласно методам, подробно описанным в статье И.А. Белых и др. [3].
Результаты и обсуждения
В первой серии экспериментов (как и для Е. coli) исследовали жизнеспособность микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры с последующим обезвоживанием, после выдерживания их в озоно-воздушной смеси в течение различного времени при комнатной температуре. Контролем служили образцы микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры, которые инкубировали в воздушной среде. В табл. 1 представлены результаты определения жизнеспособности микроорганизмов, выраженной как число КОЕ/мл, после инкубирования их в течение 1, 3 и 6 часов в озоно-воздушной смеси с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С.
Таблица 1
Жизнеспособность микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры после инкубирования в течение различного времени в озоно-воздушной смеси с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С
Как видно из представленных результатов, после инкубирования в газовой среде с озоном в течение первого часа жизнеспособность всех исследованных микроорганизмов снижается в среднем на порядок. Число КОЕ/мл бактерий Staphуlococcus aureus после озонирования в озоно-воздушной среде через 3 часа снижается с 2,1·107 до 4,6·104. Через 6 часов бактерии Staphylococcus aureus погибают. Число КОЕ/мл грибов Candida albicans снижается через 3 часа с 5,1·107 до 2,9·103. Через 6 часов клетки дрожжеподобных грибов погибают.
Подобным образом исследовали воздействие озоно-воздушной смеси на указанные выше микроорганизмы, высеянные на агаризованные среды. Для бактерий Staphylococcus aureus в качестве среды использовали (МПА), для дрожжепо-добных грибов Candida albicans — агар Сабуро. Образцы в чашках Петри инкубировали в озоно-воздушной смеси с концентрацией озона 6,8 мг/л в течение 1, 3 и 6 часов при температуре 20°С. После обработки озоно-воздушной смесью микроорганизмы инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С и 48 часов при 30°С соответственно, далее подсчитывали число КОЕ/мл [8]. Результаты этого раздела исследований представлены в табл. 2.
Таблица 2
Жизнеспособность микроорганизмов, высеянных на агаризованные среды, после инкубирования среды с микроорганизмами в течение различного времени в озоно-воздушной смеси с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С
Как видно из табл. 2, инкубирование микроорганизмов, высеянных на поверхность агаризованных сред в озоно-воздушной смеси в течение 1 часа при указанных выше условиях не влияет на число КОЕ/мл. После инкубирования в течение 3 часов наблюдается достоверное снижение числа КОЕ/мл для бактерий Staphylococcus aureus в среднем в 10 раз, а для дрожжепо-добных грибов Candida albicans — в 100 раз. После инкубирования в течение 6 часов все изучавшиеся микроорганизмы погибают.
В последующей серии экспериментов исследовали действие обработки озоном указанных выше микроорганизмов в водных средах — дистиллированной воде, физиологическом растворе и питательных средах. В качестве питательных сред для бактерий Staphylococcus aureus использовали МПБ, для дрожжеподобных грибов Candida albicans — жидкую среду Сабуро. Клетки в водных средах подвергали действию озона двумя способами. Первый способ состоял в том, что жидкие среды с высеянными в них микроорганизмами барботировали озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С в течение 10, 20 и 60 мин, после каждого указанного временного интервала отбирали пробы и высевали их для определения количества жизнеспособных микроорганизмов. При втором способе исследования проводили барботирование жидких сред без микроорганизмов озоно-кислородной смесью при тех же условиях, что и в первом способе для растворения озона в жидкости. Далее в среды с озоном вносили микроорганизмы и инкубировали их при температуре 20°С также 10, 20, 60 минут. В процессе инкубации периодически отбирали пробы и высевали для определения количества жизнеспособных клеток микроорганизмов и для подсчета числа КОЕ/мл.
В табл. 3 представлены результаты определения жизнеспособности бактерий Staphylococcus aureus, суспендированных в различных жидких средах после обработки их озоно-кислородной смесью путем барботирования.
Таблица 3
Жизнеспособность бактерий Staphylococcus aureus, суспендированных в различных жидких средах при барботировании суспензии озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С
Как видно из табл. 3, максимальный бактерицидный эффект проявлялся при барботировании клеток Staphylococcus aureus в физиологическом растворе, минимальный эффект — при барботировании в МПБ. Полная гибель бактерий наблюдалась после барботирования в течение 60 минут в дистиллированной воде и физиологическом растворе.
Аналогичные результаты были получены и в экспериментах с барботированием суспензий дрожжеподобных грибов Candida albicans (табл. 4) и споровых форм Bacillus subtilis (табл. 5)
Таблица 4
Жизнеспособность дрожжеподобных грибов Candida albicans, суспендированных в различных жидких средах при барботировании суспензии озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С
Таблица 5
Жизнеспособность споровых форм бактерий Bacillus subtilis в споровой форме, суспендированных в различных жидких средах при барботировании суспензии озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С
Как и в предыдущих экспериментах с бактериями Staphylococcus aureus, дрожжеподобные грибы Candida albicans и споровые формы бактерий Bacillus subtilis не погибают полностью в среде МПБ после барботирования озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°C. В дистиллированной воде и в физиологическом растворе при этих условиях обработки озоном происходит полная гибель данных микроорганизмов, соответственно через 90 и 120 минут. Споровая форма Bacillus subtilis менее чувствительна к действию озона по сравнению с другими видами исследованных нами вегетативных форм микроорганизмов. Для полной гибели споровой формы Bacillus subtilis необходимо было увеличить время обработки озоно-кислородной смесью при указанных выше условиях до 120 минут.
В следующей серии экспериментов было проведено изучение влияния суспензионных сред, обработанных озоном, на жизнеспособность микроорганизмов. Физиологический раствор, дистиллированную воду, МПБ и бульон Сабуро обрабатывали озонокислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л путём барботирования в течение 60 минут при температуре 20°C.
После этого микроорганизмы Staphylococcus aureus, Candida albicans и Bacillus subtilis вносили в среды, содержащие растворенный озон.
Полученные суспензии инкубировали при температуре 20°C в течение 10, 30, 60 минут (Staphylococcus aureus, Candida albicans) или 60, 90, 120 мин (споровые формы Bacillus subtilis) и определяли количество жизнеспособных клеток на 1 мл суспензии.
Жизнеспособность микроорганизмов Staphylococcus aureus и Candida albicans в обработанных озоном дистиллированной воде и в физиологическом растворе снижается в течение 60 мин на шесть порядков. В средах МПБ и Сабуро, обработанных озоном, степень снижения жизнеспособности указанных микроорганизмов за то же время на порядок меньше. Споровые формы Bacillus subtilis характеризуются более высокой устойчивостью в обработанных озоном средах, по сравнению с микроорганизмами в вегетативной форме. Степень снижения жизнеспособности Bacillus subtilis в таких средах составляет четыре порядка при инкубации в течение 120 мин. Меньшая степень снижения жизнеспособности микроорганизмов в обработанных озоном водных средах по сравнению с прямым барботированием озоно-кислородной смесью объясняется распадом растворенного озона согласно реакции: 2О3↔3О2. Одновременно озон может расходоваться на реакции с органическими веществами в средах инкубации микроорганизмов (МПБ, среда Сабуро).
Сравнительная оценка действия озона на жизнеспособность микроорганизмов разных видов и в различных средах может быть проведена на основании анализа кинетики гибели микроорганизмов. Для такой оценки, используя измерения чисел КОЕ/мл в описанных выше экспериментах, мы построили кинетические кривые гибели микроорганизмов в виде зависимостей lg Nt/N0=f (t), где Nt и N0 — число КОЕ/мл после обработки и до обработки озоном, соответственно, и t — время [2, 13].
На рис. 1-3 представлены кинетические кривые гибели микроорганизмов Staphylococcus aureus, Candida albicans и Bacillus subtilis (споровая форма).
Рис. 1. Кинетические кривые гибели бактерий Staphylococcus aureus при обработке озоно-кислородной смесью. Сплошные линии — при барботировании суспензий бактерий в дистиллированной воде (1), в 0,9% растворе хлористого натрия (2) и в МПБ (3) озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С. Пунктир — при инкубации микроорганизмов, высеянных в те же среды: дистиллированная вода (4), 0,9% раствор хлористого натрия (5) и МПБ (6), обработанные предварительно в течение 30 мин барботированием озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С
Рис. 2. Кинетические кривые гибели дрожжеподобных грибов Candida albicans при обработке озоно-кислородной смесью. Сплошные линии — при барботировании суспензий дрожжеподобных грибов в дистиллированной воде (1), в 0,9% растворе хлористого натрия (2) и в МПБ (3) озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С. Пунктир — при инкубации дрожжеподобных грибов, высеянных в те же среды: дистиллированная вода (4), 0,9% раствор хлористого натрия (5) и МПБ (6), обработанные предварительно в течение 30 мин барботированием озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С
Рис. 3. Кинетические кривые гибели споровых форм Bacillus subtilis при обработке озоно-кислородной смесью. Сплошные линии — при барботировании суспензий Bacillus subtilis в дистиллированной воде (1), в 0,9% растворе хлористого натрия (2) и в МПБ (3) озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С. Пунктир — при инкубации Bacillus subtilis, высеянных в те же среды: дистиллированная вода (4), 0,9% раствор хлористого натрия (5) и МПБ (6), обработанные предварительно в течение 30 мин барботированием озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С
Анализируя полученные результаты, можно видеть, что выраженность бактерицидного действия озона в значительной степени зависит от среды, в которой находятся микроорганизмы. Среди исследованных в настоящей работе сред летальное действие газообразного озона на микробные клетки более всего выражено при непосредственном контакте озона с клетками микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры. Число КОЕ/мл в данных условиях через 3 часа контакта с газообразной озоно-воздушной средой снижается на 4 порядка. Полная гибель микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры, происходит между 3-6 часами инкубации в атмосфере, содержащей газообразный озон в концентрации 6,8 мг/л при температуре 20°С.
При действии озона на микроорганизмы, высеянные на поверхность агаризованных сред, полная гибель микроорганизмов происходит через 6 часов. Однако темп снижения жизнеспособности микроорганизмов в процессе обработки газообразным озоном в данном случае меньше, чем в рассмотренном выше случае микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры. Об этом свидетельствует меньший наклон кинетических кривых (рис. 1-3).
По-видимому, озон вступает во взаимодействие с компонентами питательных сред, содержащих различные органические макромолекулы (белки, аминокислоты, углеводы), а также агар-агар в коллоидном состоянии и соли. В результате концентрация озона, контактировавшего с микробными клетками, существенно снижается. Нельзя исключить и образование вокруг микробных клеток своеобразных защитных зон из компонентов ростовых сред, контактирующих с поверхностью микробных клеток. На возможность существования такого механизма указывают данные [6, 12], о снижении летального действия озона за счет органических соединений.
Наиболее выраженный эффект инактивации микроорганизмов наблюдался в серии экспериментов, в которых клетки микроорганизмов, суспендированные в жидких средах, подвергались интенсивному барботированию озоном. В таких условиях гибель вегетативных форм бактерий Staphylococcus aureus и дрожжеподобных грибов Candida albicans наблюдается уже через 10 минут, а полная гибель происходит между 20-60 минутой барботирования. Повреждающее влияние барботирования в суспензионных средах на споровые формы Bacillus subtilis менее выражено. Гибель споровых форм Bacillus subtilis происходит между 90-120 минутами барботирования. Эти данные несколько отличаются от цитируемых рядом авторов результатов [4, 5, 7, 9, 11], в которых гибель спор происходит через более короткое время. Однако авторы этих сообщений ссылаются на эксперименты, проведенные со спорами актиномицетов (нитчатая форма бактерий) и грибов, а, как известно [10], споры актиномицетов и грибов являются одним из этапов репродукции этих микроорганизмов и существенно отличаются по устойчивости к физико-химическим факторам от эндоспор, продуцируемых спорообразующими видами бактерий. В этой серии экспериментов также было установлено, что выраженность летального действия барботирования озоно-кислородной смесью зависит от состава суспензионных сред. Наиболее выраженный летальный эффект наблюдается при барботировании суспензии микроорганизмов в физиологическом растворе. При барботировании суспензий микроорганизмов в дистиллированной воде количество погибших микробных клеток несколько меньше. Это видно из наклона соответствующих кинетических кривых на рис. 1-3. В МПБ и в жидкой среде Сабуро количество КОЕ/мл снижается через 60 минут (для вегетативных форм) и через 120 минут (для споровых форм) на 5 порядков, но полной гибели не происходит. По-видимому, и в этих условиях белки, аминокислоты, углеводы и другие соединения, входящие в состав МПБ и жидкой среды Сабуро, ослабляют повреждающее действие озона путем химических реакций с озоном или препятствуя контакту озона с поверхностью микробных клеток.
ЛІТЕРАТУРА
1. Белых И. А. Влияние озонированной питательной среды на кинетику роста и отмирания культуры Escherichia coli / И.А. Белых, И.П. Высеканцев, В.Д. Зинченко, С.В. Казанжан // Збірник наукових робіт ІІІ Української науково-практичної конференції з міжнародною участю "Місцеве та парентеральне використання озонотерапії в медицині", Харків, 2003. — С. 42.
2. Белых И.А. Влияние озонированных сред инкубирования и культивирования на кинетику роста и отмирания периодической культуры Escherichia coli / И.А. Белых // Актуальные проблемы медицины и биологии. —2004. — № 1. — С. 397-402.
3. Белых И.А. Токсическое действие озона на бактерии Escherichia coli / И.А. Белых, И.П. Высеканцев, А.М. Грек, А.В. Сакун, В.В. Марущенко — 2009. — № 1 — С. 48-53.
4. Гончарук В. В. Озонирование как метод подготовки питьевой воды: возможные побочные продукты и токсикологическая оценка / В.В. Гончарук, Н.Г. Потапченко, B.Ф. Вакуленко // Химия и технология воды. — 1995. — Т. 17, № 1. —C. 3-33.
5. Григорьева Л. Н. Гигиенические аспекты изменения свойств микробиоценозов окружающей среды при радиоактивном загрязнении / Л.Н. Григорьева, Г.Н. Корчак, Т.В. Бей, М.Ю. Антонов // Химия и технология воды. — 1995. — № 1. — С. 88-91.
6. Емельянова Г. Н. К вопросу о кинетике и механизме некоторых реакций концентрирования озона. Современные проблемы физической химии, т. 2. Вопрос о кинетике химических реакций / Г.Н. Емельянова, Б.В. Страхов. — М. : МГУ, 1968. — С. 149-172.
7. Кожинов В.Ф. Очистка питьевой и технической воды / В.Ф. Кожинов. — М.: Стройиздат, 1971. — 301 с.
8. Лабинская В.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований // В.С. Лабинская. — М.: Медицина, 1978. — 394 с.
9. Орлов В.А. Озонирование воды / В.А. Орлов. — М.: Стройиздат, 1984. — 88 с.
10. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / О.К. Поздеев. — М. : ГЭОТАР МЕД, 2001. — 768 с.
11. Прокопов В.А. Пути решения проблемы очистки фильтрата свалки твердых бытовых отходов г. Киева / В.А. Прокопов, Г.В. Толстопятов, Э.Д. Мактаз // Химия и технология воды. — 1995. — Т. 17, № 1. — С. 43-45.
12. Разумовский С.Д. Озон и его реакции с органическими соединениями / С.Д. Разумовский, Г.Е. Заиков. — М.: Наука, 1974. — 322 с.
13. Стейниер Р. Мир микробов / Р. Стейниер, Э. Эдельберг, Дж. Ингрэм — М.: Мир, 1979. — 486 с.
14. Achen M., Efficacy of ozone against Escherichia coli 0157:H7 on apples / M. Achen, A. E. Yousef // J Food Sci. — 2001. — Vol. 66, № 9. — P. 1380-1384.
REFERENCES
1. Belykh I. A. Vliyanie ozonirovannoj pitatel'noj sredy na kinetiku rosta i otmiraniya kul'tury Escherichia coli / I.A. Belykh, I.P. Vysekancev, V.D. Zinchenko, S.V. Kazanzhan // Zbirnyk naukovykh robit III Ukrains'koi naukovo-praktychnoi konferencii z mizhnarodnoyu uchastyu "Misceve ta parenteral'ne vykorystannya ozonoterapii v medycyni", Kharkiv, 2003. — S. 42.
2. Belykh I.A. Vliyanie ozonirovannykh sred inkubirovaniya i kul'tivirovaniya na kinetiku rosta i otmiraniya periodicheskoj kul'tury Escherichia coli / I.A. Belykh // Aktual'nye problemy mediciny i biologii. —2004. — № 1. — S. 397-402.
3. Belykh I.A. Toksicheskoe dejstvie ozona na bakterii Escherichia coli / I.A. Belykh, I.P. Vysekancev, A.M. Grek, A.V. Sakun, V.V. Maruschenko — 2009. — № 1 — S. 48-53.
4. Goncharuk V. V. Ozonirovanie kak metod podgotovki pit'evoj vody: vozmozhnye pobochnye produkty i toksikologicheskaya ocenka / V.V. Goncharuk, N.G. Potapchenko, B.F. Vakulenko // Khimiya i tekhnologiya vody. — 1995. — T. 17, № 1. —C. 3-33.
5. Grigor'eva L. N. Gigienicheskie aspekty izmeneniya svojstv mikrobiocenozov okruzhayuschej sredy pri radioaktivnom zagryaznenii / L.N. Grigor'eva, G.N. Korchak, T.V. Bej, M.Yu. Antonov // Khimiya i tekhnologiya vody. — 1995. — № 1. — S. 88-91.
6. Emel'yanova G. N. K voprosu o kinetike i mekhanizme nekotorykh reakcij koncentrirovaniya ozona. Sovremennye problemy fizicheskoj khimii, t. 2. Vopros o kinetike khimicheskikh reakcij / G.N. Emel'yanova, B.V. Strakhov. — M. : MGU, 1968. — S. 149-172.
7. Kozhinov V.F. Ochistka pit'evoj i tekhnicheskoj vody / V.F. Kozhinov. — M.: Strojizdat, 1971. — 301 s.
8. Labinskaya V.S. Mikrobiologiya s tekhnikoj mikrobiologicheskikh issledovanij // V.S. Labinskaya. — M.: Medicina, 1978. — 394 s.
9. Orlov V.A. Ozonirovanie vody / V.A. Orlov. — M.: Strojizdat, 1984. — 88 s.
10. Pozdeev O.K. Medicinskaya mikrobiologiya / O.K. Pozdeev. — M. : GEOTAR MED, 2001. — 768 s.
11. Prokopov V.A. Puti resheniya problemy ochistki fil'trata svalki tverdykh bytovykh otkhodov g. Kieva / V.A. Prokopov, G.V. Tolstopyatov, E.D. Maktaz // Khimiya i tekhnologiya vody. — 1995. — T. 17, № 1. — S. 43-45.
12. Razumovskij S.D. Ozon i ego reakcii s organicheskimi soedineniyami / S.D. Razumovskij, G.E. Zaikov. — M.: Nauka, 1974. — 322 s.
13. Stejnier R. Mir mikrobov / R. Stejnier, E. Edel'berg, Dzh. Ingrem — M.: Mir, 1979. — 486 s.
14. Achen M., Efficacy of ozone against Escherichia coli 0157:H7 on apples / M. Achen, A. E. Yousef // J Food Sci. — 2001. — Vol. 66, № 9. — P. 1380-1384.
Надійшла до редакції 22.04.2010