Різнометалічний комплекс, одержаний прямим синтезом на хімічному факультеті Київського національного університету імені Тараса Шевченка, [Cu(dmen)2] [Fe(CN)5(NO)] (dmen=N,N-диметилетилендіамін, код KL447) містить атоми міді та заліза. Це робить його потенційним стимулятором кровотворення, зокрема синтезу гемоглобіну, оскільки залізо є складовою частиною останнього, а мідь входить до складу білків, які беруть участь у зв'язуванні та транспорті іонів заліза та синтезі молекули гемоглобіну. Показано, що KL447 впливає на метаболізм заліза і міді при експериментальній анемії [1].
Вивчення впливу будь-якої хімічної сполуки на організм потребує детального дослідження її токсичної дії. Використовуючи поведінкові реакції як інтегральний показник фізіологічного стану організму та впливу на нервову систему хімічних речовин, ми показали, що різнометалічний комплекс KL447 сприяє зниженню тривожності та зростанню орієнтовно-дослідницької активності щурів, тобто не має токсичної дії на ЦНС [2].
Досліджуваний комплекс у дозі 25 мг/кг, порівнянній за вмістом заліза з терапевтичною дозою, хоча і викликає певні структурні та функціональні зміни у печінці щурів, не призводить до незворотних її пошкоджень. А значні морфо-функціональні зміни у печінці щурів відбуваються лише при дії KL447 у дозі 100 мг/кг [3].
Нирки відіграють важливу роль у метаболізмі та виведенні значної кількості речовин і водночас є одним з найчутливіших органів до дії шкідливих факторів. Аналіз морфо-функціонального стану нирок при дії KL447 особливо доцільний тому, що вони разом із печінкою депонують і виводять залізо і мідь [4, 5], які містить дана сполука. Важливо підкреслити, що сполуки заліза, і особливо міді, є досить токсичними речовинами [6].
Матеріали та методи дослідження
Досліди проведено на самках нелінійних білих щурів з початковою масою 160-190 г. Щурів утримували при стандартному світловому дні на нормальному харчовому раціоні. KL447, розведений у дистильованій воді, вводили протягом місяця інтрагастрально за допомогою зонду щоденно вранці до годування тварин у дозах 2,5 мг/кг, 25 мг/кг та 100 мг/кг. Контрольні тварини отримували дистильовану воду.
Для гістологічного аналізу нирки фіксували у рідині Буена, після стандартної гістологічної обробки заливали у парафін, робили зрізи товщиною 5-7 мкм та забарвлювали їх гематоксиліном Бьомера з дофарбуванням еозином та оранжем G [7, 8]. Функціональний стан нирок оцінювали, базуючись на візуальному аналізі препаратів та морфометричних вимірах. У кортикомедулярній зоні кіркового шару нирок вимірювали площі поперечного перерізу капсул Шумлянського-Боумена та судинних клубочків (мкм2), вираховували площі вільного простору капсул у (мкм2); вимірювали висоту епітелію проксимальних та дистальних ка-нальців нефронів (мкм). Морфометричні дослідження проводили за допомогою світлового мікроскопа Olympus BX-41 та програми Image J. Статистичну обробку результатів проводили з використанням t критерію Стьюдента. Для відповідних розрахунків використовували стандартний пакет програм статистичного аналізу Microsoft Excel 2007 для персонального комп'ютера. Вірогідною вважалась різниця між дослідом і контролем при значенні р<0,05.
Результати та їх обговорення
Морфологія нирок добре вивчена [9-11]. У щурів контрольної групи нирки мають типову для цього виду тварин будову. Інтракортикальні судинні клубочки, що розміщені в середній зоні кори і становлять приблизно 60-70 % від їх загальної кількості, відіграють основну роль у фільтрації. Саме тому увагу було зосереджено на цій зоні кіркового шару нирок. Капсули Шумлянського-Боумена (5366 320,4 мкм2) містять судинні клубочки (4235 396,3 мкм2), капілярні петлі яких утворюють сферичну структуру, вільно розташовану у капсулі. Вони мають рівномірне помірне або інтенсивне кровонаповнення. Просвіт між вісцеральним і парієнтальним листками капсули Шумлянського-Боумена дорівнює 1148 80,5 мкм2, що становить 21.4 3,9 % об'єму капсули. У нирках контрольних щурів базальні мембрани канальців та капсул Шумлянського-Боумена добре виражені (табл. 1).
Таблиця 1
Вплив різнометалічного комплексу KL447 на гломерулярний апарат нефронів у кортикомедулярній зоні коркового шару нирок щурів (M±m)
Проксимальні звивисті канальці нирок, утворені епітеліоцитами кубічної або призматичної форми, мають еозинофільну цитоплазму, містять сферичні ядра, локалізовані ближче до базальної мембрани. Клітини мають добре виражену щіткову облямівку апікального краю. Просвіти проксимальних канальців незначні. Висота епітелію проксимальних канальців дорівнює 8,56±0,68 мкм. Епітеліоцити дистальних канальців нирок мають кубічну або дещо сплощену форму, їх цитоплазма слабо еозинофільна, світла. Ядра епітеліоцитів світлі, округлі або овальні, розташовані у центрі клітини або дещо зміщені до її апікального полюсу. Висота епітелію дистальних канальців становить 6,44±0,09 мкм (рис. 1). Дистальні канальці мають значний просвіт, що не має вмісту.
Рис. 1. Вплив різнометалічного комплексу KL447 на висоту епітелію проксимальних і дистальних канальців у кортикомедулярній зоні коркового шару нирок щурів.
* — позначено вірогідні зміни відносно контролю при Р<0,05
Різнометалічний комплекс KL447 у дозі 2,5 мг/кг не впливає на морфо-функціональний стан нирок щурів. У гломерулярному апараті кортикомедулярної зони нирок не відбувається структурних змін: площі поперечного перерізу капсул Шумлянського-Боумена (5392 301,7 мкм2), судинних клубочків (4218 305,1 мкм2) та, відповідно, просвіту капсул (1148 80,5 мкм2) залишаються на рівні контролю (табл. 1). Не змінюється висота епітелію проксимальних (8,54±0,59 мкм) та дистальних (6,38±0,34 мкм) канальців (рис. 1).
Під впливом різнометалічного комплексу KL447 у дозі 25 мг/кг у нирках переважної більшості щурів істотних структурних змін не викликає. Площі поперечного перерізу капсул Шумлянського-Боумена (5579 330,9 мкм2) та судинних клубочків (4678 367,7 мкм2) залишаються майже такими ж, як у контрольних тварин. Проте частина капсул Шумлянського-Боумена і судинних клубочків трохи збільшуються у розмірах, а в окремих щурів з'являються поодинокі зменшені капсули Шумлянського-Боумена, весь просвіт яких займає судинний клубочок. Капсулярний простір практично не змінюється і дорівнює 901 109,1 мкм2, що становить 19,3 % від площі поперечного перерізу капсули (табл. 1). Структура канальців також істотно не змінюється, лише в деяких щурів невеликі ділянки кіркового шару мають розширені дистальні канальні, стінки яких утворені сплощеними епітеліоцитами. Висота епітеліальної стінки проксимальних канальців залишається на рівні контролю (8,87±0,21 мкм), а висота дистальних канальців має тенденцію до зменшення (5,63±0,49 мкм) (рис. 1). Помітних змін мікроциркуляторного русла не виявлено.
Після впливу різнометалічного комплексу KL447 у дозі 100 мг/кг нирки щурів зазнають суттєвих структурних змін, які проявляються вже в підкапсулярній зоні нирок. При цьому у нирках є зони майже не змінені, а є такі, які відреагували на дію KL447. Співвідношення їх у різних особин різне. Так, серед незмінених капсул Шумлянського-Боумена з'являються поодинокі або розміщені групами (фокальна глобальна гломерулопатія), найчастіше зменшені, капсули, в яких судинні клубочки займають весь об'єм капсули або, навпаки, дуже стиснені до одного її краю. В таких клубочках помітно зменшується кількість мезангіоцитів, про що свідчить зменшення кількості ядер у центральній зоні клубочкової часточки. Є капсули, в яких клубочки перетворюються на майже гомогенну масу з окремими ядрами. У деяких клубочках чітко виражені часточки, переповнені еритроцитами. Іноді еритроцити виявлено і в порожнині капсули Шумлянського-Боумена. Кількість змінених капсул становить в окремих особин від 5,7 до 25,7 %, (в середньому 16,9 %). Середні значення площ поперечного перерізу капсул Шумлянського-Боумена (5583 539,1 мкм2), судинних клубочків (4472 420,5 мкм2) та капсулярного простору (1110 353,2 мкм2) не змінюються, проте детальний аналіз їх розмірів показав, що значна частина капсул Шумлянського-Боумена, хоча і не відрізняється вірогідно від контролю, має тенденцію до збільшення (5768 492,3 мкм2), а приблизно 30% капсул вірогідно менші за контроль (4645 335,6 мкм2). Площі перерізу судинних клубочків як у незмінених (4409 422,6 мкм2), так і у змінених (4455 315,9 мкм2) капсулах Шумлянського-Боумена однакові. Проте капсулярний простір у змінених капсулах Шумлянського-Боумена, внаслідок зменшення розмірів самих капсул, на порядок зменшується і становить 190 71,4 мкм2 (табл. 1), що становить 4,42 0,39 % від розмірів капсул на відміну від 21.4 3,9 % у контролі.
Значні зміни відбуваються і у каналікулярному апараті нирок. Серед майже незмінених є зони, де проксимальні канальці зовсім не мають просвіту або він заповнений еозинофільним вмістом, а дистальні канальці дуже розширені. У різних особин відрізняється співвідношення незмінених і пошкоджених зон. Між канальцями, найчастіше поблизу капсул Шумлянського-Боумена, з'являються скупчення еритроцитів, що є результатом стазу крові у приносних судинах та крововиливів. Проксимальні канальці мають високий епітелій, утворений призматичними клітинами. Висота його становить 10,76±0,38 мкм, що вірогідно більше за контроль. Цитоплазма епітеліоцитів інтенсивно еозинофільна, в більшості клітин ядра зміщуються до їх центру або навіть до апікального краю. Такі структурні зміни епітеліоцитів є ознакою зернистої дистрофії та свідчать про резорбційну недостатність проксимальних канальців [9], зокрема про порушення реабсорбції білка. Дистальні канальці дуже розширені, а клітини епітеліального шару сплощені та часто з ознаками деструкції. Апікальна частина значної кількості клітин епітелію дистальних канальців зруйнована. Відбувається десквамація епітелію, тобто злущення його аж до базальної мембрани. Висота епітелію вірогідно зменшується відносно контролю і становить 4,42±0,39 мкм (рис. 1). Зміни у дистальних канальцях зумовлені як безпосередньою дією на них різнометалічного комплексу KL447, так і недостатністю функції проксимальних канальців. Ядра епітеліоцитів як проксимальних, так і дистальних канальців часто набувають неправильної форми і стають гіперхромними.
Отримані дані свідчать про певну нефротоксичність різнометалічного комплексу KL447, перші ознаки якої з'являються вже при дії комплексу у дозі 25 мг/кг. При дії KL447 у дозі 100 мг/кг за цілою низкою ознак [10-12] розвивається ниркова недостатність, обумовлена поєднанням порушень функції судинних клубочків та канальців, що призвело до зменшення рівня маси діючих нефронів. Важливо підкреслити, що KL447 у дозі 25 мг/кг, що за вмістом заліза є порівнянною з терапевтичною, не викликає істотних морфофункціональних змін у нирках.
Висновки:
1. KL447 у дозі 100 мг/кг викликає порушення структури і функції судинних клубочків та епітелію проксимальних і дистальних звивистих канальців, що призводить до ниркової недостатності.
2. KL447 у дозі 25 мг/кг, яка за вмістом заліза порівнянна з терапевтичною, не викликає суттєвих структурних змін у нирках.
3. KL447 у дозі 2,5 мг/кг не впливає на нирки щурів.
ЛІТЕРАТУРА
1. Byelinska I. Influence of the mixed-metal Cu/Fe complex [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)] (dmen=N,N-dimethylethylenediamine) on serum iron and copper levels in experimental anemia of rats / I. Byelinska, T. Rybalcheko, V. Kokozay [et al.] // Annales universitatis Mariae Curie-Sclodowska. Lublin-Polonia. — 2010. — Sectio DDD. — Vol. XXIII, N3. — P. 221-225.
2. Карпезо Н.О. Вплив різнометалічного комплексу [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)] (dmen=N,N-диметилетилендіамін) на поведінкові реакції щурів / Н.О. Карпезо, І.В. Бєлінська, В.М. Кокозей [та ін.] // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології — 2009 — Вип. 8(95). — С. 36-42.
3. Карпезо Н.О. Вплив різнометалічного комплексу [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)](dmen=N,N-диметилетилендіамін) на морфофункціональний стан печінки / Н.О. Карпезо, І.В. Бєлінська, В.К. Рибальченко [та ін.] // Доповіді Національної академії наук України. — 2011. — №3. — С. 158-163.
4. Хендерсон Д.М. Патофизиология органов пищеварения / Д.М. Хендерсон — М. Из-во БИНОМ, 2005 — 272 с.
5. Schumann K. Hohenheim Consensus Workshop: Copper / K. Schumann, H.G. Classen, H.H. Dieter, J. Konig [et al.] // European Journal of Chemical Nutrition. — 2002. — 56. — C. 469-483.
6. Вредные вещества в промышленности. Справочник для химиков инженеров и врачей. Т.Ш Неорганические и элементорганические соединения / [Под ред. Н.В. Лазарева и И.Д. Гадаскиной]. — Л. "Химия". — 1977. — 608 с.
7. Лилли Р. Патологогистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лилли — М.: Мир, 1969. — 650 с.
8. Горальський Л.П. Основи гістологічної техніки і морфо-функціональні методи досліджень у нормі та при патології. Навчальний посібник / Л.П. Горальський, В.Т. Хомич, О.І. Кононський. — Житомир: Полісся, 2005. — 288 с.
9. Серов В.В. Морфогенез дистрофии нефроцитов / В.В. Серов, В.А. Варшавський, Т.И. Ковтун, Л.А. Куприянова // Архив патологии — 1983 — Вып. 1. — С. 25-33.
10. Возианов А.Ф. Болезни почек. Атлас макропатологии и микропатологии / А.Ф. Возианов, Д.Д. Зербино, А.В. Шуляк. — Львов: Издательский дом "Наутилус", 2003. — 214 с.
11. Урология. Национальное руководство / [под ред. акад. РАМН Н.А. Лопаткина]. — Москва "ГЭОТАР-Медиа" 2009. — 1021 с.
12. Нефрология. Руководство для врачей / [под. ред. И.Е. Тареевой]. — М. "Медицина". — 2000. — 688 с.
REFERENCES
1. Byelinska I. Influence of the mixed-metal Cu/Fe complex [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)] (dmen=N,N-dimethylethylenediamine) on serum iron and copper levels in experimental anemia of rats / I. Byelinska, T. Rybalcheko, V. Kokozay [et al.] // Annales universitatis Mariae Curie-Sclodowska. Lublin-Polonia. — 2010. — Sectio DDD. — Vol. XXIII, N3. — P. 221-225.
2. Karpezo N.O. Vplyv riznometalichnoho kompleksu [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)] (dmen=N,N-dymetyletylendiamin) na povedinkovi reakcii schuriv / N.O. Karpezo, I.V. Belins'ka, V.M. Kokozej [ta in.] // Problemy ekolohichnoi ta medychnoi henetyky i klinichnoi imunolohii — 2009 — Vyp. 8(95). — S. 36-42.
3. Karpezo N.O. Vplyv riznometalichnoho kompleksu [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)](dmen=N,N-dymetyletylendiamin) na morfofunkcional'nyj stan pechinky / N.O. Karpezo, I.V. Belins'ka, V.K. Rybal'chenko [ta in.] // Dopovidi Nacional'noi akademii nauk Ukrainy. — 2011. — №3. — S. 158-163.
4. Khenderson D.M. Patofiziologiya organov pischevareniya / D.M. Khenderson — M. Iz-vo BINOM, 2005 — 272 s.
5. Schumann K. Hohenheim Consensus Workshop: Copper / K. Schumann, H.G. Classen, H.H. Dieter, J. Konig [et al.] // European Journal of Chemical Nutrition. — 2002. — 56. — C. 469-483.
6. Vrednye veschestva v promyshlennosti. Spravochnik dlya khimikov inzhenerov i vrachej. T.Sh Neorganicheskie i elementorganicheskie soedineniya / [Pod red. N.V. Lazareva i I.D. Gadaskinoj]. — L. "Khimiya". — 1977. — 608 s.
7. Lilli R. Patologogistologicheskaya tekhnika i prakticheskaya gistokhimiya / R. Lilli — M.: Mir, 1969. — 650 s.
8. Horal's'kyj L.P. Osnovy histolohichnoi tekhniky i morfo-funkcional'ni metody doslidzhen' u normi ta pry patolohii. Navchal'nyj posibnyk / L.P. Horal's'kyj, V.T. Khomych, O.I. Konons'kyj. — Zhytomyr: Polissya, 2005. — 288 s.
9. Serov V.V. Morfogenez distrofii nefrocitov / V.V. Serov, V.A. Varshavs'kij, T.I. Kovtun, L.A. Kupriyanova // Arkhiv patologii — 1983 — Vyp. 1. — S. 25-33.
10. Vozianov A.F. Bolezni pochek. Atlas makropatologii i mikropatologii / A.F. Vozianov, D.D. Zerbino, A.V. Shulyak. — L'vov: Izdatel'skij dom "Nautilus", 2003. — 214 s.
11. Urologiya. Nacional'noe rukovodstvo / [pod red. akad. RAMN N.A. Lopatkina]. — Moskva "GEOTAR-Media" 2009. — 1021 s.
12. Nefrologiya. Rukovodstvo dlya vrachej / [pod. red. I.E. Tareevoj]. — M. "Medicina". — 2000. — 688 s.
Надійшла до редакці 18.05.2011 р.ї