ДП «Науковий центр превентивної токсикології, харчової та хімічної безпеки імені академіка Л. І. Медведя МОЗ України», Київ, Україна
РЕЗЮМЕ. Мета дослідження. Ідентифікувати небезпеку і оцінити ризик репродуктивної токсичністі двох генеричних пестицидів карбендазиму різної чистоти на самців та самиць щурів Wistar Han.
Матеріали та методи дослідження. Карбендазим - 98% (К1) та 98,1% (К2) чистоти вводили щодня, крім суботи та неділі, внутрішньошлунково в дозах 2,5 і 25 мг/кг маси тіла трьом групам тварин по 20 самців і самиць у кожній протягом 10 тижнів (для самиць) та 11 тижнів (для самців). Контрольні тварини отримували еквівалентну кількість розчинника. Паралельно з контрольними і піддослідними тваринами містилися інтактні тварини, призначені для спарювання. Після закінчення періоду експозиції досліджувалися функціональні показники стану гонад і здатність тварин до відтворення потомства. У самиць вивчали стан естрального циклу, тривалість і частоту кожної його стадії. Стан репродуктивної функції у самиць враховували на 20 день вагітності. Визначали індекси спарювання, зачаття, фертильності та вагітності, враховували тривалість прекоїтального інтервалу.
Результати та обговорення. Отримані дані свідчать, що при експозиції двох генеричних речовин карбендазиму в дозі 25 мг/кг маси тіла протягом 11 тижнів проявлявся загальнотоксичний ефект (зниження маси тіла) у самців за впливу тільки К2. Всі тестові субстанції за дії максимальної дози володіють репродуктивною токсичністю і мають виражену антиандрогенну дію, що викликає зміну морфофункціональних показників стану статевих залоз у піддослідних групах самців. Крім того, відзначався негативний вплив на естральний цикл у піддослідних самиць, котрі піддавались впливові К2. Висновок. На підставі одержаних результатів можна зробити висновок, що всі вивчені сполуки карбендазиму володіють репродуктивною токсичністю в дозі 25мг/кг маси тіла. Недіючою дозою (NOEL) для всіх вивчених сполук є доза 2,5мг/кг маси тіла. В діапазоні вивчених доз спостерігається залежність «доза-ефект».
Ключові слова: гонадо-репродуктивна токсичність, щури Wistar Han, карбендазим.
Карбендазим является одним из широко используемых системных фунгицидов класса бензимидазолы, предназначенных для защиты растений от различного рода грибковых заболеваний [1]. В последнее время проведено много исследований по изучению влияния карбендазима на нецелевые объекты. По данным литературы известно, что данный пестицид — это эндокринный дизраптор, вызывающий репродуктивную токсичность, что проявляется в изменениях уровней различных гормонов. Он отрицательно влияет на стероидогенез яичек, имеет антиандрогенный эффект [2-6].
Данное исследование было проведено для оценки гонадо- и репродуктивной токсичности двух технических образцов фунгицида карбендазима различных производителей и чистоты на самцах и самках крыс линии Wistar Han.
Материалы и методы исследования. Исследования на животных проведены согласно требованиям и положениям «Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 18.03.1986) ETS №123, «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» (National Academies Press, USA, 2011) [7, 8].
Изучаласть гонадо- и репродуктивная токсичность двух образцов карбендазима разных производителей. Чистота исследуемых соединений карбендазима составляла 98 % (К1) и 98,1 % (К2). Эксперименты проведены на самцах и самках крыс Wistar Han, полученных из SPF питомника ГП «Научный токсикологический центр имени академика Л.И. Медведя МЗ Украины» в возрасте 5-6 недель и массой тела 80-100 г. Адаптационный период продолжался пять дней.
Животные были размещены в конвенционном виварии. Комната была обеспечена принудительной вентиляцией (12 объемов в час), которая исключала рециркуляцию воздуха. Температура и относительная влажность воздуха регистрировались ежедневно, колебания температуры составляли от 19 до 24 °С, влажности - от 30 до 70 %. Освещение было естественным. Животные получали деионизированную, обеззараженную УФ-облучением и очищенную обратным осмосом фильтрованную питьевую воду и сбалансированный гранулированный корм с пониженным содержанием природных фитоэстрогенов производства Альтромин (Германия) ad libitum.
Тестовые субстанции вводили ex tempore ежедневно, кроме субботы и воскресенья, внутрижелудочно с помощью зонда двум группам животных по 20 самцов и самок в каждой группе в дозах 2,5 и 25 мг/кг массы тела в течение 10 недель для самок и 11 недель для самцов. Контрольная группа самцов (20 шт) получала дистиллированную воду с эмульгатором (ОП-10) в эквивалентных количествах. Паралельно с контрольными и подопытными животными содержалась интактная группа самцов и самок, предназначенная для спаривания.
По окончании периода экспозиции исследовались функциональные показатели состояния гонад и способность животных к воспроизведению потомства. У самок изучали состояние эстрального цикла, продолжительность и частоту каждой его стадии. У самцов оценивали количество подвижных спермиев, их общее количество, а также число патологически измененных форм половых клеток. Регистрировали морфометрические показатели семенников и придатков
Состояние репродуктивной функции учитывали на 20 день беременности подопытных самок, забеременевших от интактных самцов и интактных самок, спаренных с подопытными самцами. При этом регистрировали количество желтых тел в яичниках, количество живых, мертвых и резорбированных плодов и зародышей, массу тела плодов, общую массу пометов, наличие грубых аномалий развития. Определяли индексы спаривания, зачатия, фертильности, беременности, учитывали длительность прекоитального интервала. Всех самцов при вскрытии подвергали макроскопическому обследованию. Животных взвешивали каждую неделю в течение всего периода экспозиции, а также беременных самок на 0, 6, 13 и 20 дни роst соіїит [9, 10].
Статистическая значимость межгрупповых различий (Р <0,05) оценивалась по критерию t — теста Стьюдента. Исследования проведены в соответствии с рекомендациями и требованиями Надлежащей лабораторной практики (GLP).
Результаты исследования и их обсуждение. Карбендазим технический в испытанных дозах не оказывал видимого влияния на общее состояние подопытных самцов и самок и не вызывал смертности животных. Однако наблюдался системный токсический эффект только у самцов крыс в период экспозиции при воздействии тестовой субстанции К2 на дозе 25 мг/кг, проявляющийся достоверным снижением массы тела подопытных животных (рис.1).
При изучении морфофункциональных показателей состояния половых желез в подопытных группах самцов, получавших К1 и К2 в дозе 25 мг/кг, было отмечено статистически значимое снижение общего количества сперматозоидов, количества и процента подвижных спермиев по отношению к контрольной группе, а также достоверное повышение процента патологических форм спермиев.
Рис. 1. Динамика массы тела самцов крыс в период экспозиции К2 (*-P<0,01; **-P<0,001)
При макроскопическом обследовании семенников и придатков не обнаружено видимой патологии этих органов, но в группе самцов на максимальной дозе зафиксировано статистически достоверное снижение абсолютной и относительной массы семенников при действии обеих тестовых образцов, а также снижение массы придатков наблюдалось и у К1. Статистически значимого изменения остальных исследуемых показателей в этой дозе не отмечалось (табл. 1, 2).
При изучении оплодотворяющей способности и фертильности самцов, получавших дозу 25 мг/кг (К2), которые оценивались по данным, полученным от интактных самок, наблюдалась тенденция к снижению индексов зачатия и фертильности на 15%.
В исследовании на самцах К1 и К2 в обеих дозах карбендазим не оказал отрицательного влияния на фертильность самцов, о которой судили по показателям состояния репродуктивной функции забеременевших от них интактных самок. Количество живых плодов в подопытных группах, число желтых тел в яичниках, число и процентное соотношение погибших до и после имплантации плодов, а также средняя масса плодов и общая масса помета достоверно не отличались от уровня контроля.
Тестовые субстанции карбендазима при исследовании на самках не оказали отрицательного влияния на их общее состояние. Регистрация массы тела подопытных и контрольных самок в период затравки показала, что тестируемые тестовые субстанции не индуцируют достоверного снижения массы тела в период экспозиции и беременности.
Величины индексов спаривания, зачатия, фертильности и беременности в обеих группах животных, получавших минимальную и максимальную дозу К1 и К2, статистически значимо не изменялись по сравнению с контролем, но наблюдалась тенденция к снижению индекса беременности в максимальной испытуемой дозе К2 (у двух самок отсутствует наличие живых плодов).
Таблица 1
Морфофункциональное состояние половых желез самцов крыс после периода экспозиции карбендазимом (К1)
Примечание: * - Р<0,01; ** - Р<0,001; *** - Р<0,0001 относительно группы контроля
Таблица 2
Морфофункциональное состояние половых желез самцов крыс после периода экспозиции карбендазимом (К2)
Примечание: * - Р<0,01; ** - Р<0,0001 относительно группы контроля
В течение двухнедельного периода наблюдения за эстральным циклом у самок, получавших только К2 в дозе 25 мг/кг, было отмечено статистически значимое увеличение продолжительности цикла и отдельных его стадий эструс и диэструс по отношению к контрольной группе (рис. 2).
Рис. 2. Эстральный цикл и продолжительность отдельных его стадий у самок, подвергавшихся воздействию К2 (*-P<0,05)
Выводы.
1. При внутрижелудочном введении К2 в дозе 25 мг/кг массы тела в течение 11 недель проявлялся общетоксический эффект, а именно снижение массы тела у самцов на протяжении периода экспозиции.
2. Все тестовые субстанции при действии максимальной дозы обладают репродуктивной токсичностью, что выражается в возможных изменениях морфофункциональных показателей состояния половых желез при анализе спермы у подопытных самцов, таких как: снижение общего количества сперматозоидов, количества и процента подвижных сперматозоидов, а также увеличение процента патологических форм спермиев. При воздействии К1 и К2 также проявляется выраженная антиандрогенная активность этих действующих субстанций: снижение абсолютной и относительной массы семенников, а также снижение массы придатков при действии только К1.
3. В течение двухнедельного периода наблюдения за эстральным циклом у самок, получавших К2 в дозе 25 мг/кг, было отмечено статистически значимое увеличение продолжительности цикла и отдельных его стадий (эструс и диэструс).
4. Нарушение эстрального цикла у самок и антиандрогенная активность у самцов — весьма чувствительный показатель дисбаланса половых гормонов, что идентифицировано в данном эксперименте. Данный факт подтверждает наличие у карбендазима свойств эндокринного дизраптора.
5. В диапазоне изученных доз наблюдается зависимость «доза-эффект». Установлено, что дозовый уровень для всех исследуемых соединений карбендазима, который не оказывает повреждающего действия на гонады и репродуктивную функцию самцов и самок крыс Wistar Han (NOEL), является доза 2,5 мг/кг массы тела.
ЛИТЕРАТУРА
1. Xu X. Carbendazim residues in vegetables in China between 2014 and 2016 and a chronic carbendazim exposure risk assessment / X. Xu, J. Chen, B. Li, L. Tang // Food Control. – 2018. – № 91. – P. 20–25.
2. Endocrine-disrupting activity in carbendazim-induced reproductive and developmental toxicity in rats / S.Y. Lu, J. W. Liao, M. L. Kuo [et al.] // Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. – 2004. – № 67 (19). –P. 1501–1515.
3. Ex vivo assessment of testicular toxicity induced by carbendazim and iprodione, alone or in a mixture / C. Pisani, S. Voisin, K. Arafah [et al.] //ALTEX-Alternatives to animal experimentation. – 2016. – № 33 (4). – P. 393–413.
4. Reproductive and possible hormonal effects of carbendazim / E.M. Rama, S. Bortolan, M. L. Vieira [et al.] // Regulatory Toxicology and Pharmacology. – 2014. – № 69 (3). –P. 476–486.
5. Lu S.Y. Androgen Receptor Plays a Vital Role in Benomyl- or Carbendazim-Induced Reproductive and Developmental Toxicity and Endocrine-Disrupting Activity in Rats / S.Y. Lu // Endocrine Disruptors. – IntechOpen, 2018.
6. Шепельская Н.Р. Репродуктивная токсичность фунгицида карбендазима в эксперименте на самцах и самках крыс Wistar / Н.Р. Шепельская, Л.П. Иванова, С.Д. Сапожникова, Л.И. Григоренко // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. –2013. – № 10 (2). – С. 328–329
7. Guide for the care and use of laboratory animals. – LAR Publication, National Academy Press, USA, 1996. – 140 p.
8. OECD Principles of Good Laboratory Practice. ENV/ MC/CHEM(98)17. – Environment Directorate Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, 1998. – 41 p.
9. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. Киев; 1969. – 160 с.
10. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. Киев; 1988. – 211 с.
REFERENCES
1. Xu X. Carbendazim residues in vegetables in China between 2014 and 2016 and a chronic carbendazim exposure risk assessment / X. Xu, J. Chen, B. Li, L. Tang // Food Control. – 2018. – No. 91. – P. 20-25.
2. Endocrine-disrupting activity in carbendazim-induced reproductive and developmental toxicity in rats / S.Y. Lu, J. W. Liao, M. L. Kuo [et al.] // Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. – 2004. – No. 67 (19). – P. 1501-1515.
3. Ex vivo assessment of testicular toxicity induced by carbendazim and iprodione, alone or in a mixture / C. Pisani, S. Voisin, K. Arafah [et al.] //ALTEX-Alternatives to animal experimentation. – 2016. – No. 33 (4). – P. 393-413.
4. Rama E.M. Reproductive and possible hormonal effects of carbendazim / E.M. Rama, S. Bortolan, M. L. Vieira [et al.] // Regulatory Toxicology and Pharmacology. – 2014. – No. 69 (3). – P. 476-486.
5. Lu S.Y. Androgen Receptor Plays a Vital Role in Benomyl-or Carbendazim-Induced Reproductive and Developmental Toxicity and Endocrine-Disrupting Activity in Rats / S.Y. Lu // Endocrine Disruptors. – IntechOpen, 2018.
6. Shepelskaia N. R. Reproductive toxicity of fungicide carbendazim in the experiment in male and female Wistar rats / N. R. Shepelskaia, L. P. Ivanova, S. D. Sapozhnikova, L. I. Grigorenko // International Journal of Applied and Fundamental Research. – 2013. – No. 10 (2). – P. 328-329
7. Guide for the care and use of laboratory animals. – LAR Publication, National Academy Press, USA, 1996. – 140 pp.
8.OECD Principles of Good Laboratory Practice. ENV/MC/CHEM(98)17. – Environment Directorate Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, 1998. – 41 p.
9. Methodology Guidelines for the Hygienic Evaluation of New Pesticides. – Kyiv, 1969. – 160 p.
10. Methodology Guidelines for the Hygienic Evaluation of New Pesticides. – Kyiv, 1988. – 211 p.
Надійшла до редакції 10.12.2018 р.