Т.А. Андрущенко¹, С.В. Гончаров², В.Є. Досенко²

¹Державна Установа «Інститут медицини праці імені Ю.І. Кундієва НАМН України», м. Київ, Україна
²Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, м. Київ, Україна

Резюме. Вступ. Вивчено розподіл алельних варіантів генів репарації ДНК: АТМ (rs664677), XRCC7(rs7003908) і MLH1 (rs1799977) в популяції працівників шкідливих і небезпечних професій. Поліморфізми, що вивчались, є визнаними онкомаркерами різноманітних типів і локалізацій злоякісних новоутворень, а також маркерами радіочутливості/резистентності до впливу випромінювання.
Мета роботи: виявити значення поліморфізмів генів репарації дволанцюгових розривів ДНК: XRCC7 (rs7003908), АТМ (rs664677) і репарації«невідповідностей»: MLH1 (rs1799977) у формуванні індивідуальної схильності до розвитку хронічних захворювань бронхолегеневої системи у шахтарів і працівників азбестоцементних заводів.
Матеріали та методи. Респондентами групи дослідження стали працівники азбестоцементних заводів і шахтарі, хворі на хронічні бронхолегеневі захворювання; групу контролю становили працівники без захворювань дихальної системи. Методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі визначали генотипи генів: АТМ (rs664677), XRCC7(rs7003908) і MLH1 (rs1799977).
Результати. Встановлено, що мінорні алелі генів АТМ•Т і MLH1•G, мінорна гомозигота АТМ •ТТ і гетерозигота MLH1•AG асоційовані із ризиком розвитку хронічних захворювань бронхолегеневої системи. Виявлено, що домінантні алелі генів АТМ•А, MLH1•А; домінантні гомозиготи АТМ•АА; MLH1•АА і гетерозигота АТМ•АТ сприяють резистентності до розвитку патології дихальної системи.
Висновки. Встановлені алелі: АТМ•Т (Р<=0,06, χ=3,44; OR=1,44; 95 %CI: 0,96–2,17); MLH1•G (Р<=0,002, χ²=5,06; OR=1,61; 95 %CI: 1,04–2,49) та генотипи: АТМ•ТТ (Р<=0,01, χ²=6,61; OR=2,48; 95 %CI: 1,16–5,31); MLH1•АG (Р<=0,002, χ²=9,00; OR=2,32; 95%CI: 1,29–4,21), які асоційовані з ризиком розвитку бронхолегеневої патології. А також визначені алелі: АТМ•А (Р<=0,06, χ²=3,44; OR=0,69; 95 %CI: 0,46–1,04); MLH1•А (Р<=0,002, χ²=5,06; OR=0,62; 95 %CI: 0,40–0,96) та генотип: MLH1•А/А (Р<=0,003, χ²=8,73; OR=0,43; 95 %CI: 0,24–0,79), які формують стійкість до розвитку захворювань дихальної системи у певних професійних груп.
Ключові слова: SNP, АТМ, XRCC7, MLH1, бронхолегенева патологія.

Вступ. Бронхолегенева патологія (БЛП) домінує у структурі професійної патології, її поширеність обумовлює необхідність розробки нових методів первинної профілактики і ранньої діагностики [1]. На сьогодні накопичені дані щодо однонуклеотидних поліморфізмів (SNP — single nucleotide polymorphism) у генах репарації ДНК, пов’язаних із факторами підвищеного ризику цілого ряду онкопатологій різних типів і локалізацій. Встановлено, що порушення в системі контролю за процесами репарації ДНК та апоптозу викликані не тільки генетичними та епігенетичними пошкодженнями, але й варіабельністю функціонування генів, яка обумовлена SNP [2].

Репарація дволанцюгових розривів (Double — strand break repair (DSBR)) має велике значення для виживання високодиференційованих клітин. Існує два механізми DSBR: негомологічне з’єднання кінців (Non-homologous end joining (NHEJ)) і гомологічна рекомбінація (Homologous recombination (HR)) [4, 6]. Дволанцюгові розриви ДНК можуть з’являтися в ході нормального процесу реплікації і в наслідок впливу ДНК пошкоджуючих агентів, які вважаються найбільш тяжкими формами генотоксичних пошкоджень. Різноманітні варіанти помилок DSBR призводять до різних типів мутацій і хромосомних перебудов, які індукують нестабільність геному і канцерогенез [3, 6]. Серед відомих генетичних факторів гени NHEJ відіграють важливу роль у відновленні дволанцюгових розривів ДНК за дії екзогенних факторів [12]. Ген XRCC7, відомий під назвою Proteinkinase, DNA-activated, catalytic polypeptide (PRKDC) — розміщений на 8-й хромосомі (8q11), складається з 85 екзонів та 86 інтронів, є важливим ДНК-регенератором, що бере участь у NHEJ [8]. XRCC7 кодує білок, що являє собою велику каталітичну субодиницю комплексу ДНК-ПК (DNAPKcs), яка утворює активну протеїнкіназу з гетеродимером Ku та ініціює відновлення шляхом NHEJ [13, 14]. На сьогодні в гені XRCC7 відомі понад 100 SNP, деякі з них корелюють зі злоякісними пухлинами, зокрема з раком легенів [3, 7, 11, 12].

Ген «мутації атаксії-телеангіектазії» (АТМ) локалізований на 11-й хромосомі (11q22-23 ), має довжину 150 тис. послідовностей нуклеотидів і складається з 66 екзонів. ATM кодує ДНК-залежну протеїнкіназу, локалізовану переважно в ядрі. Даний фермент бере участь у проведенні мітогенного сигналу мейотичної рекомбінації та у регуляції клітинного циклу. Відомі 88 поліморфізмів АТМ, носіям мутантних алелів характерні чутливість до опромінення, множинні вади розвитку, схильність до онкологічних захворювань [10].

Особливе місце серед клітинних систем посідає репарація "невідповідностей" ДНК (від англ. MMR — mismatch repair). Завдяки MMR можливо зберегти генетичну інформацію при потраплянні організмів в умови, за яких різко збільшується частота мутацій [9]. Як результат помилок ДНК-полімерази і рекомбінації у синтезованих ланцюгах ДНК виникають некомпліментарні залишки нуклеозидів: замість канонічних пар G-C і А-Т в ДНК з’являються пари G-G, А-А, А-С, G-T, які локально викривляють подвійну спіраль макромолекули [4]. Ген MLH1 (від англ. mutL (E. coli) homolog 1) розташований на 3 хромосомі, складається з 19 екзонів і 757 кодонів [5]. MLH1 кодує білок, що регулює заміну неправильно спарених основ ДНК та інактивується метилюванням. Зареєстровано 126 SNP генів MLH1 та MSH2, більшість з яких знаходиться на інтронній поверхні [10].

У структурі професійних факторів, які обумовлюють розвиток БЛП наявні ті, що можуть знижувати ефективність DSBR та MMR. Отже, пошук маркерів індивідуальної схильності до БЛП у працівників шкідливих і небезпечних галузей промисловості серед SNP DSBR і mMr є актуальним.

Мета роботи — виявити значення поліморфізмів генів репарації двониткових розривів ДНК: XRCC7 (rs7003908), АТМ (rs664677) і репарації «невідповідностей» ДНК: MLH1 (rs1799977) у формуванні індивідуальної схильності до розвитку хронічних захворювань бронхолегеневої системи у шахтарів і працівників азбестоцементних заводів.

Методика. До дослідження увійшли дві категорії працівників шкідливих і небезпечних галузей промисловості України (n=215): працівники азбестоцементних заводів (АЦЗ) (n=95) і шахтарі вугільних шахт України (n=120). Для порівняльного аналізу були сформовані групи дослідження і контролю. Групу дослідження склали працівники АЦЗ і шахтарі з БЛП (хронічний бронхіт, хронічне обструктивне захворювання легенів, пневмоконіоз), до групи контролю увійшли респонденти, в анамнезі яких не було БЛП, але їхній стаж та умови праці були співставні з даними респондентів групи дослідження. Загальна характеристика груп дослідження наведена в табл. 1.

Таблиця 1. Загальна характеристика респондентів дослідження

Матеріалом для дослідження була венозна кров, яку забирали у стерильних умовах у моновети об’ємом 2,7 мл з антикоагулянтом (калієвою сіллю етилендіамінтетра-оцтової кислоти) (11,7 ммоль/л) (“Sarstedt”, Німеччина). Було створено уніфікований банк генетичного матеріалу осіб, які мали контакт із генотоксичними агентами (пил фіброгенної дії, хімічні речовини та фізичні фактори) для оцінки віддалених наслідків впливу техногенних факторів із застосуванням сучасних молекулярно-генетичних технологій. ДНК виділяли з лейкоцитів периферичної крові з використанням наборів «NeoPrep100DNA», «NEOGENE», Україна. За допомогою 7500 Fast Real-time PCR System (“Applied Biosystems”, США) та TaqMan SNP визначали генотипи генів: АТМ (rs664677), XRCC7 (rs7003908), MLH1 (rs1799977) і проводили аналіз за дискримінацією алелів (рис. 1).

Рис. 1. Результати дискримінації алелів гена АТМ (rs664677) із застосуванням Real-time PCR у респондентів контрольної групи (а) та у респондентів групи дослідження (б) Примітка: І — гомозиготи АА, ІІ — гетерозиготи AT, ІІІ — гомозиготи TT, VI — проба, що не містила ДНК.

Отримані результати статистично опрацьовували з використанням програм Orion 7.0, Statistica 10, Excel 2000. При цьому вірогідність відмінностей визначали по х² — критерію, значення р<0.05 вважали достовірним.

Результати та обговорення. Аналіз вивчення алельних поліморфізмів генів АТМ (rs664677), XRCC7 (rs7003908) і MLH1 (rs1799977) показав, що частота мінорних алелів: АТМ•Т і MLH1•G у групі дослідження була достовірно вищою у порівнянні з групою контроля і становила: АТМ•Т — 47,8 %; MLH1•G — 36,1, відповідно у групі контролю: АТМ•Т — 38,8 %; MLH1•G — 26,0. У той же час частота домінантних алелів генів АТМ (rs664677) і MLH1 (rs1799977) була достовірно вищою серед респондентів групи контролю: АТМ•А — 61,2 %; MLHl•А — 74,0, відповідно в групі дослідження: АТМ•А — 52,2 %; MLffi•А — 63,9. При вивченні розподілу алелів гену XRCC7 (rs7003908) достовірних відмінностей не знайдено. Аналіз частот розподілу алелів генів АТМ (rs664677), XRCC7 (rs7003908) і MLH1 (rs1799977) в популяції шахтарів і працівників АЦЗ представлені в табл. 2.

Таблиця 2. Аналіз частот розподілу алелів АТМ (rs664677), XRCC7 (rs7003908), MLH1 (rs1799977) у популяції шахтарів і працівників азбестоцементних заводів

Наступним етапом нашого дослідження стало вивчення частот генотипів генів АТМ (rs664677), XRCC7 (rs7003908) і MLH1 (rs1799977). Слід відзначити, що одержані значення частот генотипів були близькими до популяційних частот європейської популяції, які за літературними даними становлять:
- домінантні гомозиготи: АТМ•АА — 30–35 %; XRCC7•СС — 33 %; MLH1•АА — 25–45 %;
- гетерозиготи: АТМ•AT — 50 %; XRCC7•СТ — 50 %; MLH1•AG — 35–45 %;
- мінорні гомозиготи: АТМ•ТТ — 13 %; XRCC7•ТТ — 17 %; MLH1•GG — до 10 % [5, 11].

При дослідженні частот генотипів АТМ (rs664677) встановлено, що в групі контролю домінантні гомозиготи АА становили — 35,2 %; гетерозиготи AT — 52 %; мінорні гомозиготи TT — 12,8 % та відповідно в групі дослідження: АТМ•АА — 31,1 %; АТМ•АТ — 42,2 %; АТМ•ТТ — 26,7 % (р<0,03). Одержані результати вказують на те, що розподіл частот генотипів АТМ (rs664677) суттєво відрізняється від частот мінорних гомозигот у контрольній групі та в групі працівників з БЛП (табл. 3).

Таблиця 3. Частотний (%) розподіл генотипів генів АТМ (rs664677), XRCC7 (rs7003908) і MLH1 (rs1799977) у популяції шахтарів і працівників азбестоцементних заводів

При вивченні частот генотипів XRCC7 (rs7003908) у групі контролю домінантні гомозиготи становили— 44,8 %; гетерозиготи — 40,8 %, мінорні гомозиготи — 14,4 % і відповідно у групі дослідження: XRCC7•CC — 46,7 %, XRCC7•CT — 42,2 %, XRCC7•ТТ — 11,1 % (р<0,7). Отримані результати вказують на те, що розподіл частот генотипів XRCC7(rs7003908) суттєво не відрізняється в контрольній та в дослідній групі (таблиця 2).

Частота алельних варіантів гена MMR-MLH1 (rs1799977) в нашому дослідженні була такою: MLH1•АА — 56 %; MLH1•G — 36,0 %, MLH1•GG — 8 % у групі контролю. Відповідно в групі дослідження: домінантні гомозиготи АА — 35,6 %, гетерозиготи AG — 56,7 %, мінорні гомозиготи GG — 7,7 % (Р<0,008). Аналіз частот генотипів генів АТМ (rs664677), XRCC7 (rs7003908) і MLH1 (rs1799977) у популяції шахтарів і працівників АЦЗ представлений у табл. 3.

За допомогою статистичної обробки даних: OR (od ratio), χ² були встановлені алелі і генотипи, асоційовані з ризиком розвитку БЛП, ними виявилися: мінорні алелі АТМ•Т і MLH1•G, мінорна гомозигота АТМ•ТТ і гетерозигота MLH1•AG. А також встановлено алелі і генотипи, які сприяють резистентності до розвитку патології дихальної системи. Це домінантні алелі генів АТМ•А, MLH1•A; домінантні гомозиготи АТМ•AA; MLH1•AA і гетерозигота АТМ•АТ.

Таким чином, отримані результати вказують на асоціацію між зміненими алелями генів АТМ (rs664677), і MLH1 (rs1799977) та ймовірністю ризику розвитку БЛП.

Висновки

1. Встановлено алелі: АТМ•Т (Р<=0,06, χ²=3,44; OR=1,44; 95 %CI: 0,962,17); MLH1•G (Р<=0,002, χ²=5,06; OR=1,61; 95 %CI: 1,04–2,49) та генотипи: АТМ•ТТ (Р<=0,01, χ²=6,61; OR=2,48; 95 %CI: 1,16–5,31); MLH1•АG (Р<=0,002, χ²=9,00; OR=2,32; 95 %CI: 1,29–4,21), які асоційовані з ризиком розвитку бронхолегеневої патології.

2. Визначено алелі: АТМ•А (Р<=0,06, χ²=3,44; OR=0,69; 95 %CI: 0,46–1,04); MLH1•А (Р<=0,002, χ²=5,06; OR=0,62; 95 %CI: 0,40–0,96) та генотип: MLH1•AA (Р<=0,003, х²=8,73; OR=0,43; 95 %CI: 0,24–0,79), які формують стійкість до розвитку захворювань дихальної системи у певних професійних груп.

Література

1. Измеров Н.Ф. Профессиональные заболевания органов дыхания (Национальное руководство) // [под ред. Н.Ф. Измерова, А.Г. Чучалина.] —Москва. —Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2015. —С. 119–48.

2. Уржумов П.В. Полиморфизмы генов NBS1 и PARP1 и эффективность репарации ДНК / П.В. Уржумов, А.В. Погодина, А.В. Аклеев // Вестник Челябинского государственного университета. —2013. —№7(298). —Биология. вып.2. —С. 107-8.

3. DNA double-strand break repair gene XRCC7 genotypes were associated with hepatocellular carcinoma risk in Taiwanese males and alcohol drinkers // Hsieh Y.H., Chang W.S., Tsai CW. et al.// Tumour Biol. —2015. —№36(6). —Р. 4101–4106.

4. Variants in double-strand break repair genes and breast cancer susceptibility / B. Kuschel, A. Auranen, S. McBride [et al.] // Hum. Mol. Genet. —2002. —№11. —Р. 1399–1440.

5. Immunohistochemical pattern of MLH1/MSH2 expression is related to clinical and pathological features in colorectal adenocarcinomas with microsatellite instability / G. Lanza, R. Gafa, I. Maestri [et al] // Mol Pathol. —2002. —№15(7). —Р. 741–749.

6. Litvinov S.V. The main repair pathways of double-strand breaks in the genomic DNA and interaction between them / S.V. Litvinov // Cytology and Genetics/ —2014. —v. 48. —№ 3. —Р. 64–77.

7. Genetic variation in DNA repair gene XRCC7 (G6721T) and susceptibility to breast cancer / M. Nasiri, I. Saadat, S. Omidvari et al. // Gene. —2012. —V. 505 (1). —Р. 195–197.

8. The role of Ille 3434Thr XRCC7 gene polymorphism in Differentiated Thyroid Cancer risk in a Iranian population / M. Rahimi, S. Fayaz, A. Fard-Esfahani [et al.], Iran. Biomed. J. —2012. —№16(4). —Р. 218–222.

9. Suter C.M. Germline epimutation of MLH1 in individuals with multiple cancers / C.M. Suter, D.L. Martin, R.L. Ward / Nat Genet. —2004. —№ 36. —Р. 497–501.

10. The molecular genetic analysis of common ATM gene mutations among patients with Ataxia-telagiectasiasuspection / Tretyak B., Makukh H., Kitsera N. [et al.] // Factors of experimental evolution of organisms. —2015. —V. 16. —P. 251–255.

11. XRCC7 rs7003908 polymorphism and Helicobacter pylori Infection — Related Gastric Antrum Adenocarcinoma / Wang C., Huang X-Y., Yao J-G. [et al.] // Int. J. Genomics. —2013. —P. 1246–1252.

12. The rs7003908 (T>G) polymprphism in the XRCC7 gene and the risk of cancers / Xiao M., Shen Y., Chen L. et al. // Mol. Biol. Rep. —2014. —№41(6) . —Р. 3577–3582.

REFERENCES

1. Izmerov N. F. Occupational respiratory diseases (National Guide)// [edited by N. F. Izmerov, A. H. Chuchalina.] – Moscow. – Publishing group “GEOTAR-Media”, 2015 – P. 119–48.

2. Urzhumov P. V. Polymorphisms of genes NBS1 and PARP1 and efficiency of DNA repair / P. V. Urzhumov, A. V. Pohodina, A. V. Akleev // Bulletin of Chelyabinsk State University. – 2013. – No. 7(298). – Biology, ed. 2. – P.107–8. 

3. DNA double-strand break repair gene XRCC7 genotypes were associated with hepatocellular carcinoma risk in Taiwanese males and alcohol drinkers // Hsieh YH., Chang WS., Tsai CW. et al.// Tumour Biol. –2015. – No.36(6). – Р. 4,101–4,106.

4. Variants in double-strand break repair genes and breast cancer susceptibility / B Kuschel, A. Auranen, S.McBride [et al.] // Hum. Mol. Genet. – 2002. – No. 11. –  Р. 1,399–1,440.

5. Immunohistochemical pattern of MLH1/MSH2 expression is related to clinical and pathological features in colorectal adenocarcinomas with microsatellite instability / G. Lanza, R. Gafa, I. Maestri [et al] // Mol Pathol. – 2002. – No.15(7). –
P. 741–749.

6. Litvinov S.V. The main repair pathways of double-strand breaks in the genomic DNA and interaction between them / S.V.Litvinov // Cytology and Genetics/ - 2014. – V. 48. – No. 3. – Р. 64–77.

7. Genetic variation in DNA repair gene XRCC7 (G6721T) and susceptibility to breast cancer / M. Nasiri, I. Saadat, S. Omidvari et al. // Gene. – 2012. – V. 505 (1). –
P. 195–197.

8. The role of Ille 3434Thr XRCC7 gene polymorphism in Differentiated Thyroid Cancer risk in an Iranian population / M. Rahimi, S. Fayaz, A.  Fard-Esfahani [et al.], Iran. Biomed. J. – 2012. – No. 16(4). – Р. 218–222.

9. Suter C.M. Germline epimutation of MLH1 in individuals with multiple cancers / C.M. Suter, D.L. Martin, R.L. Ward / Nat Genet. – 2004. – No. 36. – Р. 497–501.

10. The molecular genetic analysis of common ATM gene mutations among patients with Ataxia-telagiectasiasuspection / Tretyak B., Makukh H., Kitsera N. [et al.] // Factors of experimental evolution of organisms. – 2015. – V. 16. – P. 251–255.

11. XRCC7 rs7003908 polymorphism and Helicobacter pylori Infection – Related Gastric Antrum Adenocarcinoma / Wang C., Huang X-Y., Yao J-G. [et al.] //Int. J. Genomics. – 2013. – P. 1,246–1,252.   

12. The rs7003908 (T>G) polymorphism in the XRCC7 gene and the risk of cancers / Xiao M., Shen Y., Chen L. et al. // Mol. Biol. Rep. – 2014. – No. 41(6). – Р. 3,577–3,582.

Надійшла до редакції 29.06.2018 р.