Вивчення мутагенної та антимутагенної дії ентеросорбентів на прикладі лікарського препарату "ентеросгель" (паста для перорального застосування)

  • Автори: І.В. Болтіна, Н.В. Кокшарьова, Є.Л. Костик, Т.В. Ткачук, Є.Н. Струменська
  • УДК: 576.312.32.38:612.014.482
Завантажити прикріплення:

И.В. Болтина к.биол.н., Н.В. Кокшарева д.биол.н., Е.Л. Костик, Т.В. Ткачук, Е.Н. Струменская к.мед.н.*

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, г. Киев
*Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, г. Киев

РЕЗЮМЕ. Результати проведеного дослідження свідчать про те, що ентеросорбент Ентеросгель (паста для перорального вживання) виробництва ЗАТ ЕОФ "КРЕОМА-ФАРМ" володіє антимутагенними властивостями, що, можливо, відкриває нові підходи до використання препарату для профілактики уражень слизової оболонки ШКТ, викликаних, наприклад, радіонуклідним навантаженням, а також деякими іншими виробничими чинниками, що мають мутагенний ефект.
Ключові слова: ентеросгель, мутагенна дія, антимутагенні властивості.

Лекарственный препарат Энтеросгель (паста для перорального применения) представляет собой гидрогель метилированных клеток и является химически синтезированным энтеросорбентом. Известно, что химические вещества могут индуцировать генные, хромосомные и геномные мутации и давать при этом высокую специфичность в отношении тех или иных типов мутаций. В этой связи при оценке мутагенного потенциала вещества используется набор методов, позволяющих регистрировать все типы генетических изменений.

Стандартная схема испытаний лекарственных препаратов [1] включает в себя четыре теста: учет генных мутаций на микроорганизмах (тест Эймса) или на дрозофиле; учет доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей; учет хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей и учет хромосомных аберраций или сестринских хроматидных обменов в культуре лимфоцитов человека.

Общим для этих тестовых систем является то, что используемые в них методы позволяют поэтапно решать две различные задачи: выявление потенциальных мутагенов и оценка их генетической активности

Цель проведенных экспериментальных исследований — оценка мутагенного и антимутагенного действия лекарственного препарата Энтеросгель (паста для перорального применения).

Согласно поставленным задачам исследовали: мутагенную активность лекарственного препарата Энтеросгель (паста для перорального применения) в трех тестах: на индукцию обратных генных мутаций у Salmonella typhimurium (тест Эймса без и с метаболической активацией); на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro без и с метаболической активацией; на индукцию аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей in vivo.

Изучение антимутагенной активности лекарственного препарата Энтеросгель изучали в тесте на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro без и с метаболической активацией.

Тест на индукцию аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей in vivo

Мутагенную активность лекарственного препарата Энтеросгель (паста для перорального применения) в тесте на индукцию аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей in vivo исследовали на белых нелинейных мышах, самцах, весом 18-20 г, которые были получены из питомника клиники лабораторных животных ЧП "Биомодельсервис" (г. Киев, ул. Э. Потье, 14). Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины. В подопытные и контрольные группы входило по 6 животных.

Во время проведения эксперимента животные содержались в виварии в стандартных пластиковых клетках, группами по 6 голов, при температуре окружающей среды 20-22°С, влажности воздуха 50-60%, стандартном световом режиме "день-ночь". Препараты хромосом клеток костного мозга готовили по методу H.J.Evans [2]. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием критериев Стьюдента [3].

При воздействии лекарственного препарата Энтеросгель (паста для перорального применения) во всех испытанных дозах гибели животных и клинических симптомов интоксикации не наблюдалось. Поведение подопытных мышей не отличалось от контрольных. Лекарственный препарат Энтеросгель (паста для перорального применения) в дозах от 5,0 до 0,5 г/кг веса тела животного не индуцировал статистически достоверного превышения спонтанной частоты аберраций хромосом. В то же время в группе животных, затравленных Циклофосфаном, отмечено статистически достоверное (Р < 0,001) превышение спонтанной частоты аберраций, что доказывает адекватность использования данной тест-системы для оценки мутагенных свойств химических агентов.

В тесте Эймса и в тесте на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro лекарственный препарат Энтеросгель (паста для перорального применения) вносили в следующих концентрациях:
• 10,0 мг/мл — максимальная концентрация за весь курс для человека;
• 5,0 мг/мл — обычный курс лечения для человека;
• 2,50 мг/мл — доза, превышающая суточную в 4 раза;
• 1,25 мг/мл — двойная суточная доза;
• 0,625 мг/мл — суточная доза для человека.

Эксперимент в обоих тестах проводили в двух параллельных вариантах — без метаболической активации и с активацией микросомальной активирующей смесью — S-9 mix. В вариантах без метаболической активации регистрируют действие прямых мутагенов — соединений, индуцирующих мутации за счет активности первичной структуры исследуемого вещества. Действие же промутагенов — соединений, эффект которых обусловлен образованием мутагенных метаболитов — регистрируют в вариантах эксперимента с метаболической активацией.

Тест Эймса

Наличие мутагенного эффекта в тесте Эймса учитывали по индукции обратных мутаций от ауксотрофности к прототрофности по гистидину. С целью выявления разных типов мутаций в эксперименте использовали два индикаторных штамма S. typhimurium: ТА-98 (his D 3052, rfa, ∆ uvr B, + R: рkM 101), регистрирующий мутации по типу смещения рамки считывания и ТА-100 (his G 46, rfa, ∆ uvr B, + R: рkM 101), регистрирующий мутации по типу замены пар оснований, которые были получены из Лаборатории Эймса (Bruce Ames Laboratory, Department of Molecular and Cell Biology, University of California at Berkeley, 401 Barker Holl, 94720-0001) в 1993 году. При исследовании мутагенной активности лекарственного препарата Энтеросгель (паста для перорального применения) методом стандартного чашечного теста, предложенного D.M. Maron и B.N. Ames [4], обнаружен слабый мутагенный эффект в максимальной концентрации за весь курс — 10,0 мг/мл в экспериментах на двух штаммах ТА-98 и ТА-100 без и с метаболической активацией, а также во второй концентрации — 5,0 мкг/мл (обычный курс лечения). Однако, учитывая активность препарата как в отношении питательной среды, так и в отношении бактерии (ложномутагенный эффект, который был получен в стандартном чашечном тесте), более адекватным в данном случае считается тест с преинкубацией, в котором отсутствует фактор соприкосновения сорбента с твердой питательной средой. Сущность его заключается в том, что суспензия бактерий, раствор изучаемого соединения и активирующая смесь (если эксперимент с метаболической активацией) инкубируются совместно при +37°С в течение 0,5-3 часов, затем отбирается бактерия и вносится в 2 мл расплавленного полужидкого агара при +45°С и наслаиваются на селективный агар. Дальнейшая инкубация происходит на чашке в агаризованной среде, как в обычном тесте Эймса. Результаты этого теста представлены в таблице 1.

Таблица.1

Кратность превышения количества ревертантных колоний S. typhimurium на разных штаммах в исследованиях с преинкубацией

Из таблицы видим, что слабый мутагенный эффект наблюдается в максимальной концентрации за весь курс — 10,0 мг/мл в эксперименте на штамме ТА 98 с метаболической активацией.

Таким образом, лекарственный препарат Энтеросгель (паста для перорального применения), исследованная в тесте на индукцию обратных генных мутаций у Salmonella typhimurium (тест Эймса) с преинкубацией, проявляет слабый мутагенный эффект только в максимальной концентрации за весь курс (10,0 мг/мл) в варианте эксперимента с метаболической активацией на индикаторном штамме ТА-98, которая не является лимитирующей при оценке безопасности лекарственного препарата Энтеросгель (паста для перорального применения).

Тест на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro

Основу культивирования лимфоцитов периферической крови и приготовления препаратов хромосом составлял стандартный полумикрометод [5], но с модификациями, принятыми в лаборатории мутагенеза [6]. Отбор метафазных пластинок для цитогенетического анализа, классификация и учет аберраций хромосом были общепринятыми. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием критериев Стьюдента [3].

Учитывали: частоту аберраций хромосом, количество анеуплоидных клеток (возможный канцерогенный риск), количество мультиаберрантных клеток (возможные нарушения системы репарации ДНК).

Итак, в тесте на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro в вариантах эксперимента без и с метаболической активацией в концентрациях от максимальной за весь курс (10,0 мг/мл) до суточной дозы (0,625 мг/мл) мутагенной активности лекарственного препарата Энтеросгель (паста для перорального применения) не выявлено.

Исследования антимутагенной активности лекарственного препарата проводили в тесте на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro в тех же концентрациях, что и при изучении мутагенной активности.

В первом варианте эксперимента Энтеросгель добавляли в каждый флакон через 3 часа после добавления Митомицина-С (концентрация мутагена 10 мкг/мл — как и в положительном контроле). Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Основные цитогенетические показатели при добавлении Энтеросгеля (паста для перорального применения) в культуру лимфоцитов периферической крови человека через три часа после добавления Митомицина-С

Из данных таблицы видно, что при добавлении Энтеросгеля через три часа после Митомицина-С, достоверного снижения аберраций хромосом не получено, хотя при высоких дозах тенденция к этому явно просматривается.

Из этой же таблицы следует, что в двух высших концентрациях — максимальной и обычной дозе лечения за весь курс было обнаружено статистически достоверное снижение анеуплоидных клеток по сравнению и индукцией Митомицином-С. В остальных концентрациях достоверного снижения анеуплоидных клеток обнаружено не было.

С целью исключения прямого взаимодействия мутагена с сорбентом, этот же эксперимент производился с преинкубацией. Схема "преинкубации" состояла в том, что клетки крови человека обрабатывались Митомицином-С, а через три часа после "отмывания" мутагена, воспроизводилась стандартная схема культивирования (табл. 3).

Таблица 3

Основные цитогенетические показатели при добавлении Энтеросгеля (паста для перорального применения) в культуру лимфоцитов периферической крови человека с преинкубацией Митомицина-С

Из данных таблицы видно, что время действия сорбента не играет особой роли для проявления его антимутагенных свойств. При этом наблюдается достоверное улучшение всех цитогенетических показателей, а именно: частоты метафаз с аберрациями, анеуплоидных и мультиаберрантных клеток при двух максимальных концентрациях Энтеросгеля.

Итак, энтеросорбент Энтеросгель (паста для перорального применения) производства ЗАО ЭОФ "КРЕОМА-ФАРМ" обладает антимутагенными свойствами, что, возможно, открывает новые подходы к использованию препарата для профилактики поражений слизистой ЖКТ, вызванных, например, радионуклидной нагрузкой, а также некоторыми другими производственными факторами, обладающими мутагенным эффектом.

В результате можно сделать вывод, что только комплексное исследование лекарственных препаратов может достаточно точно ответить на вопрос о наличие мутагенных свойств у исследуемого вещества. Кроме того, при изучении лекарственных препаратов, наряду с исследованиями мутагенной активности, целесообразно проводить исследования антимутагенной активности фармпрепаратов для уточнения и расширения сферы их применения. Еще необходимо отметить, что важен индивидуальный подход при исследованиях каждой лекарственной субстанции во избежание получения ложноположительных мутагенных эффектов, как в случае изучения Энтеросгеля в стандартном чашечном тесте Эймса.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації) //[за ред. член-кореспондента АМН України О.В. Стефанова] — К.: Авіцена. — 2001. — 528 с.

2. Evans H.J. Cytological methods for detecting chemical mutagens. In: Hollaender A. ed. Chemical mutagens: principles and methods for their detection. / H.J Evans //New York, London, Plenum Press. — 1976. — Vol. 4. — P. 1 — 29.

3. Атраментова Л.А. Статистические методы в биологии. Учебник для студентов высших учебных заведений / Л.А.Атраментова, О.М Утевская. — Горловка: "Видавництво Ліхтар", 2008. — 247 с.

4. Maron D.M. Revised for the Salmonella mutagenicity test. / D.M. Maron, B.N. Ames // Mut. Res. — 1983. — Vol 113. — Р. 172 — 215.

5. Hungerford D.A. Leucocytes cultured from small inoculate of whole blood and preparation metaphase chromosomes by treatment with hypotic KCl. / D.A. Hungerford //Stain Techn. — 1965. — V. 40. — P. 333-338.

6. А.с. (Свідоцтво про державну реєстрацію прав автора на твір) Модифікація методу вивчення мутагенної активності речовин (метафазного аналізу аберацій хромосом в культурі лімфоцитів периферичної крові людини) in vitro з метаболічною активацією / Болтіна І.В. — № 23794, заяв. 21.12.2007; опубл. 05.03.2008.

 

REFERENCES

1. Doklinichni doslidzhennya likars'kykh zasobiv (metodychni rekomendacii) //[za red. chlen-korespondenta AMN Ukrainy O.V. Stefanova] — K.: Avicena. — 2001. — 528 s.

2. Evans H.J. Cytological methods for detecting chemical mutagens. In: Hollaender A. ed. Chemical mutagens: principles and methods for their detection. / H.J Evans //New York, London, Plenum Press. — 1976. — Vol. 4. — P. 1 — 29.

3. Atramentova L.A. Statisticheskie metody v biologii. Uchebnik dlya studentov vysshikh uchebnykh zavedenij / L.A.Atramentova, O.M Utevskaya. — Gorlovka: "Vidavnictvo Lіkhtar", 2008. — 247 s.

4. Maron D.M. Revised for the Salmonella mutagenicity test. / D.M. Maron, B.N. Ames // Mut. Res. — 1983. — Vol 113. — Р. 172 — 215.

5. Hungerford D.A. Leucocytes cultured from small inoculate of whole blood and preparation metaphase chromosomes by treatment with hypotic KCl. / D.A. Hungerford //Stain Techn. — 1965. — V. 40. — P. 333-338.

6. A.s. (Svidoctvo pro derzhavnu reestraciyu prav avtora na tvir) Modyfikaciya metodu vyvchennya mutahennoi aktyvnosti rechovyn (metafaznoho analizu aberacij khromosom v kul'turi limfocytiv peryferychnoi krovi lyudyny) in vitro z metabolichnoyu aktyvacieyu / Boltina I.V. — № 23794, zayav. 21.12.2007; opubl. 05.03.2008.

Надійшла до редакції: 23.02.2011