Л.О. Сахно, кандидат біол. наук, Н.А. Пархоменко*, кандидат біол. наук, В.В. Сарнацька, доктор біол. наук, Л.О. Юшко, кандидат біол. наук, Є.О. Снєжкова, кандидат біол. наук, О.С. Сидоренко, кандидат тех. наук, Л.М. Корнеева, В.Г. Ніколаев, доктор мед. наук, проф., член-кор. НАН України
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ
*Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів Державної ветеринарної та фітосанітарної служби України
РЕЗЮМЕ. Мета: Вивчити антимікробні властивості та поглинальну активність активованих волокнистих вуглецевих сорбентів марки АУТ-М(АУТ) та АУВМ-"Днепр"-МН(АУВМ) до та після покриття палігексаметиленгуанідин хлоридом (ПТМГ) для визначення оптимального кількісного і якісного складу ПГМГ-вмісних композитів на сорбційній основі.
Матеріали та методи. Протимікробна дія зразків вуглецевих сорбентів вивчалась відносно культури Pseudomonas aeruginosa 27/99, Staphylococcus epidermidis 14990 та Proteus vulgaris HX19 No 222. Сорбційна активність визначалась щодо маркерних барвників, вітаміну В12сироваткового альбуміну людини і некон’югованого білірубіну у шутельному режимі.
Результати. Доведено, що власна протимікробна дія вуглецевих сорбентів збільшується після іммобілізації ПГМТна 10–50%. Виразність антибактеріального ефекту залежить від кількості іммобілізованого ПГМГ, типу сорбційної матриці та чутливості мікроорганізмів. Показано, що сорбенти після покриття ПГМГ зберігають більшу частину адсорбційної ємності щодо речовин різної молекулярної маси, гідрофільної та гідрофобної природи.
Висновки. Іммобілізація ПГМГ на волокнисті вуглецеві сорбенти призводить до посилення їх власної протимікробної дії відносно збудників гнійного процесу, якими є Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa та Proteus vulgaris. ПГМГ-вмісні композити на основі АУВМ, що мають більший у порівнянні з композитами на основі АУТ антибактеріальний та сорбційний потенціал, можуть розглядатися як перспективні аплікаційні засоби профілактики та лікування ранової інфекції.
Ключові слова: аплікаційні вуглецеві сорбенти, полігексаметиленгуанідини, аплікаційні бактерицидні композити.
Проблема лікування та профілактики ранової інфекції до сьогоднішнього дня залишається однією з найбільш злободенних у хірургії. Незважаючи на постійне удосконалення методик оперативних втручань кількість інфекційних ускладнень залишається високою і становить від 3 до 15% [1]. При цьому у структурі післяопераційної летальності ранова інфекція становить до 75% від усіх випадків [2]. Однією з вагомих причин такої ситуації є критичне збільшення кількості бактеріальних штамів, резистентних до широкого кола антибіотиків, які сьогодні широко використовуються для боротьби з рановою інфекцією [3, 4]. У зв’язку цим пошук альтернативних підходів щодо попередження та лікування локальної та генералізованої ранової інфекції є актуальним завданням. Перспективним напрямком у цій галузі може стати створення композиційних ранових покриттів, що поєднують потужні детоксикаційні властивості сорбційних матриць та високу протибактеріальну активність сучасних антисептичних засобів. їхня локальна дія може бути більш ефективною, ніж антибіотиків через їх швидку нейтралізацію рановим ексудатом, що, у свою чергу, перешкоджає досягненню у вогнищі інфекції необхідного антибактеріального потенціалу та є однією з причин формування антибіотикорезистентних мікроорганізмів.
На роль сорбційної матриці ідеально підходять сучасні волокнисті вуглецеві сорбенти з великою поглинальною ємністю та унікальними сорбційно-кінетичними характеристиками, що забезпечують швидке поглинання з ранового вмісту великої кількості різноманітних біологічно активних компонентів, у тому числі: продукти білкового катаболізму та протеолізу, бактеріальні ендотоксини та мікробні клітини, біогенні аміни та медіатори запалення, що викликає зменшення інтенсивності місцевої судинної і запальної реакції [5]. Особливості їхньої поверхні та значний сорбційний потенціал дозволяють проводити іммобілізацію багатьох біологічно активних лігандів без залучення зшиваючих агентів, зберігаючи при цьому значну частину поглинальної ємності [6].
Серед сучасних антисептичних засобів заслуженою увагою користуються препарати на основі гуанідину. Серед них одним з найбільш поширених і відомих є хлоргексидин біглюконат, що виявляє виразну бактерицидну дію щодо грампозитивних та грамнегативних бактерій. Він ефективно використовується проти анаеробих, але є менш активним по відношенню до аеробних та більшості факультативно-аеробних бактерій [7]. Ще одним представником антисептиків гуанідинового ряду є полігексаметиленбігуанідин (ПГМБ), який у складі пов’язок на марльовій та біоцелюлозній основі забезпечує широкий спектр антимікробної активності та більш високу у порівнянні з хлоргексидином біосумісність, служить надійним бар’єром для зовнішнього проникнення мікроорганізмів у рану [8–9].
У представленій роботі у якості антисептичного агента був використаний високомолекулярний полігексаметиленгуанідин хлорид (ПГМГ), який завдяки полімерній природі має більш високу у порівнянні з хлоргексидином та ПГБГ антимікробну активність, є більш стабільним та менш токсичним для організму людини і тварин та [7, 10]. Крім того, ПГМГ одержуються за нескладною технологією шляхом поліконденсації без використання одного з вихідних компонентів — хлорціану високотоксичної сполуки, що вигідно відрізняє його від хлоргексидину та ПГМБ [11]. Завдяки фізико-хімічним властивостям ПГМГ може бути іммобілізований на сорбційній матриці шляхом бінарного синтезу. Прикладом такого виробу є біоцидний сорбент для очистки питної води на основі активованого вугілля [12], а також двошаровий перев’язувальний засіб на основі перфорованих віскозних та легкоплавких термопластичних волокон, просочених хлоргексидином або ПГМГ [13].
Мета проведених досліджень полягала у вивченні зміни антимікробного ефекту та сорбційної активності активованих волокнистих вуглецевих сорбентів після їх покриття ПГМГ для визначення оптимального кількісного та якісного складу ПГМГ-вмісних аплікаційних композитів на сорбційній основі.
Матеріали та методи
У роботі в якості сорбційної основи були використані активовані вуглецеві волокнисті сорбенти АУВМ-«Днепр»-МН (Броварський завод порошкової металургії, Україна) та АУТ-М (ОАО «Світлогорськ Хімволокно, Біларусь) у вигляді матеріалу, а антисептичної складової полігексамeтилeнгуанідин хлорид (ВАО «Шосткинський завод хімічних реактивів, Україна).
Для визначення концентрації ПГМГ у водних розчинах застосовувався адаптований спектрофотометричній метод, заснований на утворенні кольорових комплексів ПГМГ з еозином Н [14].
Сорбційна ємність за бензолом (Vs) волокнистих вуглецевих сорбентів до та після іммобілізації ПГМГ визначалась за зміною ваги дослідних зразків після насичення парами бензолу протягом 24 годин. Сорбційна активність щодо маркерних барвників (метиловий оранжевий, конго червоний та феноловий червоний) (Sigma, США), вітаміну В12, сироваткового альбуміну людини (САЛ) і гідрофобного метаболіту — некон’югованого білірубіну (Merck, Германия) оцінювались у шутельному режимі [15]. Концентрацію метилового оранжевого, конго червоного, фенолового червоного та вітаміну В12 визначали за допомогою спектрофотометричного методу при довжині хвилі 431, 477, 430 та 360 нм відповідно. Концентрацію CAJI та білірубіну визначали за допомогою тест-наборів Protein (Total) виробництва BioSystems reagents & instruments, Барселона, Іспанія та Bilirubin S виробництва PLIVA-Lachema Diagnostika sro, Brno, Чехія. Величина адсорбції визначалась за зниженням вмісту маркерної речовини у розчинї після контакту із зразками вуглецевих сорбентів та ПГМГ-вмісних композитів на їх основі та розраховувалась на 1 г маси або 1 см2 площі.
Для оцінки протимікробної дії зразків використовували культури епідермального стафілококу (Staphylococcus epidermidis 14990), синьогнійної палички (Pseudomonas aeruginosa 27/99) та вульгарного протею (Proteus vulgaris НХ 19 No 222). 18-добова культура бактерій у концентрації 100±20 тис. мікробних клітин у 1 мл в кількості 0,2 мл висівалась на чашки Петрі з твердим поживним середовищем (м’ясо-пептонний бульон, Himedia ). Через 20±5 хвилин одну половину поверхні середовища покривали зразком стерільного сорбенту або ПГМГ-вмісного композиту, іншу — стерильною марлевою серветкою. Сорбенти та марлю попередньо змочували 1 мл фізіологічного розчину. Чашки інкубували у термостаті при 37°С протягом 120±15 хвилин, потім зразки сорбентів та марлі видаляли з поверхні середовища. Чашки інкубували за температурою 37°С протягом 18–24 годин, після чого підраховували кількість колоній у обох секторах.
Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми Microsoft Excel, достовірність результатів визначали за t-критерієм Ст’юдента.
Результати досліджень та їх обговорення
З метою оцінки підвищення антимікробної активності сорбційних матриць за рахунок іммобілізації ПГМГ були отримані дослідні зразки вуглецевих композитів з різною кількістю ПГМГ, що коливалась у діапазоні від 0,8 до 10% та від 1,5 до 27% для активованих вуглецевих волокнистих сорбентів АУТ-М (АУТ) та АУВМ-МН (АУВМ) відповідно.
Залежність антимікробної активності отриманих композитів від кількості іммобілізованого ПГМГ була вивчена у відношенні до культури синьогнійної палички (табл. 1 та 2). Двогодинний контакт культури з матеріалом АУТ до іммобілізації (покриття) ПГМГ призводив до зниження мікробної кількості на 18,4±8,7 % (табл. 1). Максимальна загибель мікробних клітин, що становила 68,5±19,2 %, мала місце після контакту мікробної культури з АУТ, покритим ПГМГ у кількості 7,9 %. При цьому гальмування мікробного росту у порівнянні з непокритим АУТ становило 49,5±14,8%. При більшій (10,0 %) та меншій (4,5 %) кількості ПГМГ, іммобілізованого на матеріалі АУТ, гальмуючий ефект падав відповідно на 17,2 та 22,2 %.
Таблиця 1. Антимікробна активність ПГМГ-вмісних композитів на основі волокнистого вуглецевого сорбент АУТ щодо культури синьогнійної палички
Активований вуглецевий волокнистий сорбент АУВМ (непокритий) продемонстрував більш виразний у порівнянні з непокритим АУТ антибактеріальний ефект (табл. 2).
Таблиця 2. Антимікробна активність ПГМГ-вмісиих композитів на основі волокнистого вуглецевого сорбенту АУВМ щодо культури синьогнійноТ палички
Мікробна кількість після контакту з непокритим АУВМ знижувалась на 40,6±18,4%. Гальмування мікробного росту зростало по мірі збільшення кількості іммобілізованого ПГМГ. Максимальний інгібуючий ефект (77,4±10,3 %) досягався після контакту культури синьогнійної палички з АУВМ, що містить 16,0 % ПГМГ, та був на 37,6±11,4 % вищим, ніж після контакту з непокритим АУВМ. Підвищення кількості іммобілізованого ПГМГ до 27,0 % выкликало зниження гальмуючого ефекту на 20 %.
Антибактеріальна активність волокнистих вуглецевих сорбентів до та після іммобілізації ПГМГ в кількості від 3,8 до 10,9 % для АУТ та від 10,9 до 27,0% для АУВМ була визначена також у відношенні до епідермального стафілокока та вульгарного протея.
Епідермальний стафілокок був ще більш чутливим до дії вуглецевих сорбентів всіх видів. Так, двогодинний контакт культури епідермального стафілокока з непокритими матеріалами АУТ і АУВМ призводив до зниження мікробної кількості на 21,4 та 58,9 % відповідно. Після контакту зі зразками матеріалів АУТ, що містять 3,8 та 7,9 % ПГМГ, спостерігалось збільшення антибактеріального ефекту до 42,9 та 41,7% відповідно. Контакт зі зразками матеріалів АУВМ, що містять 10,9 та 16 % ПГМГ, призводив до зниження кількості живих мікробних клітин на 81,7±10,5 та 84,8± 10,6 % відповідно. При збільшенні кількості ПГМГ, іммобілізованого на АУТ до 10,9% та на АУВМ до 27,0%, антимікробний ефект падав до 15,6 та 8,5 % відповідно. Двох годин контакту ПГМГ-вмісних дослідних зразків на основі АУТ та АУВМ з культурою вульгарного протея було цілком достатньо для повного знищення мікробних клітин на поверхні поживного середовища.
Таким чином, знешкодження мікробних клітин, що спостерігається після контакту бактеріальної культури з волокнистими вуглецевими сорбентами, зростає після іммобілізації на них ПГМГ. Антибактеріальний ефект ПГМГ-вмісних композитів залежить від кількості іммобілізованого ПГМГ, типу сорбційної матриці та чутливості мікроорганізмів. Найбільше зростання протимікробної активності має місце після іммобілізації 79 та 160 мг ПГМГ на 1 г АУТ та АУВМ відповідно. Подальше збільшення вмісту ПГМГ у складі аплікаційних композитів призводить до зниження їх антимікробної дії, тобто не має сенсу.
Вплив вищезазначеної кількості ПГМГ на поглинальну активність активованих волокнистих вуглецевих сорбентів АУТ та АУВМ була вивчена щодо парів бензолу, низько-, середньо- та високомолекулярних речовин, а також гідрофобного маркерного метаболіту — некон’югованого білірубіну. Результати тестування представлені в табл. 3 та 4. Враховуючи те, що йдеться про аплікаційні композиційні матеріали, втрата адсорбційної ємності розраховувалась на одиницю площі. Іммобілізації ПГМГ (79 мг на 1г або 1,1 мг на 1 см2) викликали зниження адсорбційної активності матеріалу АУТ у відношенні до низькомолекулярних маркерних барвників до 65%, середньомолекулярного маркеру вітаміну В12 на 15%, альбуміну і некон’югованого білірубіну на 44 і 33 % відповідно. Втрата сорбційної ємності за бензолом, що характеризує сумарний об’єм сорбційних пор, становила 20 %, знижуючись від 0,592 до 0,478 см3/г. Матеріал АУВМ після іммобілізації 160 мг/г або 1,9 мг/см2 ПГМГ зберігав від 57 до 97% адсорбційної активності щодо маркерних барвників. Адсорбція вітаміну В12 у порівнянні з непокритим АУВМ відрізнялась на 30 %, поглинання альбуміну зменшувалась на 49 %, а некон’югованого білірубіну навпаки зростало на 33 %. Сорбційна ємність за бензолом знижувалась від 1,200 до 0,731см3/г.
Таблиця З. Антимікробна активність ПГМГ-вмісних композитів на основі волокнистого вуглецевого сорбенту АУВМ щодо культури синьогнійної палички
Таблиця 4. Адсорбційна ємність активованого волокнистого вуглецевого матеріалу АУВМ та ПГМГ-вмісного композита на його основі щодо маркерних речовин
Проведені дослідження показали, що іммобілізація ПГМГ меншою мірою впливає на адсорбційну активність активованого волокнистого вуглецевого матеріалу АУВМ, ніж матеріалу АУТ, у відношенні до низькомолекулярних барвників. Після іммобілізації ПГМГ втрата сорбційної ємності АУТ у відношенні до середньо — та високомолекулярних маркерів була на 14,2 та 4,4 % меншою, ніж АУВМ. Поглинання некон’югованого білірубіну матеріалом АУТ падало після покриття ПГМГ на 33%, тоді як іммобілізація ПГМГ на АУВМ викликала збільшення адсорбції пігменту на 33 %.
Висновки. Покриття полігексаметиленгуанідин хлоридом активованих волокнистих вуглецевих матеріалів АУТ та АУВМ призводить до посилення їхньої власної протимікробної дії відносно збудників гнійного процесу, якими є Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa та Proteus vulgaris.
Після іммобілізації полігексаметиленгуанідин хлориду волокнисті вуглецеві матеріали зберігають більшу частину адсорбційної активності, що було показано у відношенні до речовин різної молекулярної маси, гідрофільної та гідрофобної природи.
Аплікаційні ПГМГ-вмісні композити на основі АУВМ мають більший антибактеріальний ефект та сорбційний потенціал у порівнянні з композитами на основі АУТ.
ЛІТЕРАТУРА
1. Инфекционный контроль в хирургии / А.А. Шалимов, В.В. Грубник, А.И. Ткаченко [и др.] — Киев, 2001. — 121с.
2. Деллинджер ЭЛ. Профилактическое применение антибиотиков в хирургии / Э.П. Деллинджер // Клин, микроб, антимикроб, химиотерапия. — 2001. — №3 — С. 260–265.
3. Solomkin S. Antibiotic resistance in postoperative infection / S. Solomkin // Crit. Care med. — 2001. — №4 (SI). — P. 97–99.
4. Magiorakos A.P. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance / A.P. Magiorakos, A. Srinivasan, R.B. Carey // Clin. Microbiol. Infect. — 2012. — 18. — P. 268–281.
5. Eretskaya E.V. Application sorption: experience in clinical use and prospects of development / E.V. Eretskaya, L.A. Sakhno, V.G. Nikolaev // Biomater. Artif. Cells Immobilization Biotechnol. — 1991. — 1, № 1. — P. 129–145.
6. Physical and biological modification of carbon sorbents / V.G. Nikolaev, E.V. Eretskaya, E.A. Snezhkova E.A. [et al] // J. Clinic. Mater. — 1992. — 11, №1. — P. 125–128.
7. Лопырев B.A. Применение солей полигексаметиленгуани-дина в качестве препаратов, обладающих антимикробной активностью по отношению к анаэробной и смешанной инфекции/ В.А. Лопырев, М.Г. Воронков [и др.] // Пат. № 2143905 RU, 2000.
8. Clinical evaluation of a PHMB-impregnated biocellulose dressing on paediatric lacerations / G. Elzinga, J. van Doom, A.M. Wiersema [et al] // J. Wound Care. — 2011. — 20, № 6. — P. 280–284.
9. Preventing nosocomial infections. Dressings soaked in poly-hexamethylenebiguanide (PHMB)] / C.L. Salas, F.O. Gymez, P.V. Estudillo [et al.] // Rev Enferm. — 2000. — 29, № 6. — P. 43–48.
10. Ефимов K.M. Полигуанидины — класс малотоксичных дезсредств пролонгированного действия / К.М. Ефимов, П.А. Гембицкий, А.Г. Снежко // Дезинфекционное дело. — 2000. — №4. — С. 32–36.
11. Verdicchio R. Antimicrobial compositions / R. Verdicchio // Пат. 4587266 США, 1986.
12. Биоцидный полимерный сорбент для обеззараживания водных сред / Ю.А. Лейкин, Т.А. Черкасова, А.В. Рощин [и др.] // Пат. № 2312705 RU, 2006.
13. Антимикробный нетканный материал для перевязочных средств / Б.В. Заметта, Н.В. Пузанова, Е.И. Кучкова [и др.] // Пат. № 54774 RU, 2006.
14. Способ количественного определения концентрации ПГМГхл в воде. / К.М. Ефимов, Н.И. Данилина, Е.О. Овчаренко [и др.] // Пат. 2252413 RU, 2005.
15. Сарнацкая В.В. Влияние полигексаметиленгуанадина на поглотительную активность углеродных аппликационных сорбентов / В.В. Сарнацкая, Л.А. Юшко, Л.А. Сахно // Сучасні проблеми токсікології, харчової та хімічної безпеки. — 2013. — №3. — С. 44–51.
REFERENCES
1. Infekcionnyj kontrol' v khirurgii / A.A. Shalimov, V.V. Grubnik, A.I. Tkachenko [i dr.] — Kiev, 2001. — 121s.
2. Dellindzher EL. Profilakticheskoe primenenie antibiotikov v khirurgii / E.P. Dellindzher // Klin, mikrob, antimikrob, khimioterapiya. — 2001. — №3 — S. 260–265.
3. Solomkin S. Antibiotic resistance in postoperative infection / S. Solomkin // Crit. Care med. — 2001. — №4 (SI). — P. 97–99.
4. Magiorakos A.P. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance / A.P. Magiorakos, A. Srinivasan, R.B. Carey // Clin. Microbiol. Infect. — 2012. — 18. — P. 268–281.
5. Eretskaya E.V. Application sorption: experience in clinical use and prospects of development / E.V. Eretskaya, L.A. Sakhno, V.G. Nikolaev // Biomater. Artif. Cells Immobilization Biotechnol. — 1991. — 1, № 1. — P. 129–145.
6. Physical and biological modification of carbon sorbents / V.G. Nikolaev, E.V. Eretskaya, E.A. Snezhkova E.A. [et al] // J. Clinic. Mater. — 1992. — 11, №1. — P. 125–128.
7. Lopyrev B.A. Primenenie solej poligeksametilenguani-dina v kachestve preparatov, obladayuschikh antimikrobnoj aktivnost'yu po otnosheniyu k anaerobnoj i smeshannoj infekcii/ V.A. Lopyrev, M.G. Voronkov [i dr.] // Pat. № 2143905 RU, 2000.
8. Clinical evaluation of a PHMB-impregnated biocellulose dressing on paediatric lacerations / G. Elzinga, J. van Doom, A.M. Wiersema [et al] // J. Wound Care. — 2011. — 20, № 6. — P. 280–284.
9. Preventing nosocomial infections. Dressings soaked in poly-hexamethylenebiguanide (PHMB)] / C.L. Salas, F.O. Gymez, P.V. Estudillo [et al.] // Rev Enferm. — 2000. — 29, № 6. — P. 43–48.
10. Efimov K.M. Poliguanidiny — klass malotoksichnykh dezsredstv prolongirovannogo dejstviya / K.M. Efimov, P.A. Gembickij, A.G. Snezhko // Dezinfekcionnoe delo. — 2000. — №4. — S. 32–36.
11. Verdicchio R. Antimicrobial compositions / R. Verdicchio // Пат. 4587266 США, 1986.
12. Biocidnyj polimernyj sorbent dlya obezzarazhivaniya vodnykh sred / Yu.A. Lejkin, T.A. Cherkasova, A.V. Roschin [i dr.] // Pat. № 2312705 RU, 2006.
13. Antimikrobnyj netkannyj material dlya perevyazochnykh sredstv / B.V. Zametta, N.V. Puzanova, E.I. Kuchkova [i dr.] // Pat. № 54774 RU, 2006.
14. Sposob kolichestvennogo opredeleniya koncentracii PGMGkhl v vode. / K.M. Efimov, N.I. Danilina, E.O. Ovcharenko [i dr.] // Pat. 2252413 RU, 2005.
15. Sarnackaya V.V. Vliyanie poligeksametilenguanadina na poglotitel'nuyu aktivnost' uglerodnykh applikacionnykh sorbentov / V.V. Sarnackaya, L.A. Yushko, L.A. Sakhno // Suchasni problemy toksikolohii, kharchovoi ta khimichnoi bezpeky. — 2013. — №3. — S. 44–51.
Надійшла до редакції 15.07.2014 p.