Є.А. Баглій, доктор мед. наук, Н.М. Недопитанська, кандидат біол. наук, В.С. Лісовська

ДП «Науковий центр превентивної токсикології, харчової та хімічної безпеки імені академіка Л.І. Медведя МОЗ України», м. Київ

РЕЗЮМЕ. Мета. Дослідити генотоксичність ципроконазолу при багаторазовому введенні у мікроядерному тесті на гепатоцитах та еритроцитах кісткового мозку мишей за умов модифікації активності ферментів, які метаболізують ксенобіотики. Матеріали і методи. Експерименти виконані на мишах лінії С57ВL/6J. Внутрішньошлунковое введення впродовж 14 діб у дозах: ципроконазол — 2,5 та 50 мг/кг, карбендазим (анеуген — позитивний контроль щодо мікроядер гепатоцитів) — 75 мг/кг. Одноразова інтраперитоніальна ін`єкція у дозах: циклофосфан, кластоген (позитивний контроль щодо мікроядер еритроцитів кісткового мозку) — 20 мг/кг, нітрозодіетиламін — 56 мг/кг. Через 24 години після останнього введення проводилась часткова гепатектомія, через 96 годин після операції — евтаназія та приготування цитологічних препаратів. На мазках кісткового мозку аналізували по 2000 поліхроматофільних еритроцитів (ПХЕ), печінки — по 1000 гепатоцитів на скло.
Результати. Кластогени циклофосфан і нітрозодіетиламін більше ніж утричі підвищували мікронуклеогенез у ПХЕ та у 2,3 раза в гепатоцитах порівняно з контролем, ауеноген карбендазим — у півтора раза, відповідно (р≤0,05). Ципроконазол у недіючій щодо онкогенного ефекту дозі (2,5 мг/кг) не індукував збільшення кількості як ПХЕ, так і гепатоцитів із мікроядрами. Натомість, в ефективній за канцерогенністю дозі (50 мг/кг) ципроконазол спричиняв зростання кількості ПХЕ з мікроядрами на 28% (р≤0,05), гепатоцитів — на 36% (р≥0,05). Висновок. Модифікація метаболізму ципроконазолом в умовах повторних надходжень не спричиняє накопичення сталих порушень геному, які б виявились під час активації проліферації гепатоцитів. Отримані результати вкладаються у гіпотезу рецепторного механізму канцерогенної дії коназолів.
Ключові слова: Ципроконазол, мікроядерний тест, гепатоцити, поліхроматофільні еритроцити, миші.

Ципроконазол (2RS, 3RS; 2RS, 3SR)-2-(4-хлорфеніл)-α-(1циклопропіл-етил)-1H-1,2,4-триазоло-1-етанол) належить до хімічного класу коназолів, які широко використовуються в якості протигрибкових лікарських засобів та пестицидів. Механізм їхньої фунгіцидної дії обумовлений гальмуванням біосинтезу ергостеролу. Для деяких з них встановлені онкогенні властивості для лабораторних тварин. Відомо, що ципроконазол індукує пухлини печінки у мишей і з-поміж коназолів є найбільш активним канцерогеном. Виникнення пухлин пов’язують із модифікацією активності мікросомальних оксидаз — ферментів, що забезпечують метаболізм ксенобіотиків. Актуальним залишається детальне вивчення механізму канцерогенної дії цих речовин взагалі, та ципроконазолу зокрема, а також визначення релевантності даного ефекту для людини [1–5]. Доведено, що активність ферментів, відповідальних за метаболізм ксенобіотиків, значно змінюється впродовж 14-30 діб. Не виключено, що в цей період накопичуються мутагенні метаболіти, відповідальні за трансформацію клітин. Між тим, в літературі вкрай обмежена кількість робіт, присвячених саме впливу ципроконазолу на генетичний апарат клітин органу–мішені канцерогенної дії. Визначення канцерогенної небезпеки хімічних факторів зазвичай ґрунтується на аналізі результатів хронічних досліджень та експериментів із вивчення механізму канцерогенезу. Тому поряд з обов’язковими тестами широко використовують додаткові тести [6–8], в тому числі мікроядерний тест [9–10]. Модифікації мікроядерного тесту [11–14] дозволяють вивчати органну специфічність генотоксичної дії, власне кажучи, генотоксичну дію короткоіснуючих метаболітів, які утворюються в цьому органі. Тому мета даної роботи — дослідити генотоксичність ципроконазолу при багаторазовому введенні у мікроядерному тесті на гепатоцитах та еритроцитах кісткового мозку мишей за умов модифікації активності ферментів, які метаболізують ксенобіотики.

Дослідження органотропної генотоксичності ципроконазолу поряд із розширенням інформації щодо його канцерогенних властивостей сприятиме також накопиченню даних про можливості використання мікроядерного тесту для прогнозування канцерогенного ефекту.

Матеріали і методи

Ципроконазол (ISO), CAS №: 94361-06-5. Хімічна назва (IUPAC) — (2RS,3RS;2RS,3SR)-2-(4-хлорфеніл)-α-(1циклопропілетил)-1H-1,2,4-триазоло-1-етанол, належить до хімічного класу коназолів.

У роботі використовувався Ципроконазол, 95 %, технічний, виробництва фірми “Yangzhou National Chemical Westzhong Company” (КНР).

Речовина зберігалась у темному, сухому та прохолодному місці.

В якості експериментальної моделі були взяті миші лінії С57ВL/6J, 60 самців масою тіла 19,5–21,5 г, оскільки саме у таких тварин цієї лінії виявлено канцерогенний ефект ципроконазолу [2]. В усіх загиблих тварин, а також тварин після евтаназії, шляхом цервікальної дислокації, відповідно до плану експерименту проводили патологоанатомічний розтин.

Програма представлених експериментальних досліджень враховує гуманне ставлення до тварин [15].

Піддослідні та контрольні лабораторні тварини знаходились в однакових умовах в клітках типу Т4, по 6–9 голів. Корпус кліток (40х30х15 см³) виготовлений з міцної пластмаси та накритий металевою ґратованою кришкою. Підстилка — деревна тирса, що змінювалась тричі на тиждень. Клітки мились та стерилізувались двічі на місяць. Раціон віварію стандартизований, корм для тварин збалансований, з усіма необхідними компонентами та складений відповідно до норм, встановлених Наказом МОЗ України. Вода з міського водогону, відстояна, кімнатної температури. Поїлки — скляні 0,5 літрові пляшки зі скляними наконечниками. Пиття — без обмежень. Температура повітря — від 20 до 22°С, відносна вологість — від 40 до 45 %. Освітлення в кімнатах природне. Щодня проводився огляд тварин, оцінювалась поведінка, рухливість, апетит, стан волосяного покриву, шкіри та слизових оболонок. Щотижнево визначалася маса тіла та її приріст.

Досліджувані дози речовини: Ципроконазол (2,5 та 50 мг/кг), внутрішньошлункове введення; Циклофосфан (Україна, ВАТ «Київмедпрепарат») — доза 20 мг/кг (позитивний контроль щодо мікроядер кісткового мозку), одноразова інтраперитоніальна ін`єкція [9]. Через 24 години проводилась евтаназія тварин. Карбендазим (Sharda, Індія) у дозі 75 мг/кг був взятий в якості позитивного контролю щодо гепатоцитів: як гепатоканцероген у мишей та індуктор мікроядер через ауеногенний ефект [16–17]. Тварини контрольної групи отримувала воду з ОП-10 (0,05%).

Схема експерименту: внутрішньошлункове введення за допомогою зонду 5 разів на тиждень упродовж 14 діб, після чого проводилась гепатектомія. Через 96 годин після операції проводилась евтаназія тварин (дислокація шийних хребців). Розчини готувались щоденно, ex tempore на відстояній водогінній воді з ОП-10. Корекція доз з урахуванням маси тіла тварини проводилась щотижня.

У додатковому експерименті було використано 20 мишей-самців лінії С57ВL/6J з масою тіла 19,5–21,5 г. Десяти мишам вводили інтраперитонеально гепатоканцероген нітрозодіетиламін (Sigma) у дозі 56 мг/кг, однократно [18]. На другу добу робили гепатектомію. А через 72 години після операції — евтаназію тварин. Розчини готувались щоденно, ex tempore на стерильній дистильованій воді. Тварини контрольної групи отримували воду з ОП-10, як і у попередньому дослідженні.

На розтині макроскопічному обстеженню підлягали всі внутрішні органи і тканини. Для приготування цитологічних препаратів гепатоцитів вилучали шматочок печінки розміром 0,3х0,3 см та фіксували в 10 % забуференому нейтральному формаліні. Через 2 тижні фіксації готували суспензію клітин та робили мазки, які фіксували в суміші етилового спирту з льодяною оцтовою кислотою (3:1), фарбували 2,5% ацетоорсеїном із дофарбовуванням цитоплазми клітин 1% спиртовим розчином світлого зеленого.

Для приготування препаратів кісткового мозку із стегнової кістки видаляли мозок та робили мазки, які фарбували по Паппенгейму-Крюкову.

Препарати аналізували у проникаючому світлі за допомогою об’єктиву з масляною імерсією при збільшені 10х90. Аналізу підлягали лише цілі, неушкоджені клітини. На мазках гепатоцити виглядають як клітини полігональної форми з ядром бордового кольору та прозорою зелено-блакитною цитоплазмою. Поліхроматофільні еритроцити — клітини округлої форми, ядро бордового кольору, грубої структури з чергуванням темних та світлих ділянок, цитоплазма — сірувато-блакитна. Мікроядра — гомогенно зафарбовані хроматинові тільця бордового кольору, які за розміром не перевищують чверті діаметра основного ядра і знаходяться поряд з основним ядром (рис. 1).

Рис. 1. Поліхроматофільний еритроцит з мікроядром, дія циклофосфану в дозі 20 мл/кг, одноразова інтраперитоніальна ін’єкція. (Фарбування по Паппенгейму-Крюкову; імерсія 10х90)

Рис. 2. Гепатоцит з мікроядром, дія карбендазиму в дозі 75 мл/кг упродовж 2 тижнів. (Фарбування ацетоорсеїном та світлим зеленим; імерсія 10х90)

У мазках печінки нараховували 1000 гепатоцитів на кожну окрему тварину та визначали їх кількість з мікроядрами (‰). У мазках кісткового мозку нараховували 2000 ПХЕ на кожну окрему тварину та визначали їх кількість з мікроядрами (‰). Окрім цього, для контролю токсичної дії речовини визначали долю ПХЕ від загального числа еритроцитів при підрахунку 200 еритроцитів [11].

Статистична оцінка маси тіла та приросту маси тіла, а також результатів цитогенетичного аналізу проводилась шляхом порівняння визначених показників у піддослідних та контрольних групах за допомогою параметричних за t–критеріем Стьюдента і непараметричного критерію Манна-Уітні після встановлення близькості розподілу даних до нормального за критерієм Шапіро-Уілкса. В разі нормального розподілу використовувався параметричний t-критерій для незалежних виборок, при відсутності такого розподілу — непараметричний критерій Манна-Уітні. Різниця кількості клітин з мікроядрами оцінювалась за критеріем χ2 із поправкою Ейтса на безперервність.

Таблиця 1

Розподіл тварин по групах

Статистичні розрахунки проводились за допомогою пакету комп'ютерних програм «Statistica 6.0, Stat Soft».

Досліджуваний препарат вважається цитогенетично активним при статистично достовірному збільшенні кількості та частоти клітин з мікроядрами, хоча б в одній із піддослідних груп у порівнянні з контролем.

Результати досліджень і їх обговорення.

Протягом введення препарату не встановлено загибелі тварин і щонайменших клінічних ознак, які б свідчили про токсичний вплив Ципроконазолу, 95 %, технічного, виробництва фірми “ Yangzhou National Chemical Westzhong Company” (КНР) на організм мишей. Не встановлено змін маси тіла при щотижневому зважуванні мишей (табл. 2), які отримували ципроконазол у дозі 2,5 мг/кг, тоді як у тварин, які отримували карбендазим і ципроконазол у дозі 50 мг/кг, спостерігалось зниження маси тіла на 3 %, а приросту маси тіла на другому тижні експерименту у два рази, у порівнянні з контролем.

Таблиця 2

Динаміка маси і приросту маси тіла щурів самців (г)

Хоча загибелі тварин, пов’язаної з введенням речовин, не спостерігалось, невелике зниження маси тіла на 3% як з контролем, так і початковим рівнем цього показника, свідчать про загально токсичну дію карбендазиму і ципроконазолу у цих дозах. Після гепатектомії визначалась майже однакова смертність через післяопераційні ускладнення. Так, в групі тварин негативного і позитивного (карбендазим) контролю, а також в групах, які отримували Ципроконазол, загинуло по 2 миші (25 %). На розтині при патоморфологічному дослідженні мозку, серця, легенів, печінки, нирок, селезінки, шлунка, товстого і тонкого кишковику, тимуса, наднирників, підшлункової та щитовидної залоз, гіпофіза епідидимісу, простати, сім`яників й інших органів макроскопічних ознак патології не виявлено.

За допомогою класичного індуктора мікроядер у ПХЕ кісткового мозку Циклофосфану була перевірена придатність моделі для мікроядерного тесту.

Як видно з таблиці, однократне інтраперитоніальне введення мишам-самцям С57BL Циклофосфану у дозі 20 мг/кг спричиняло статистично значиме підвищення кількості ПХЕ з мікроядрами більш як утричі порівняно з контролем. Слід зауважити, що проведення гепатектомії у контрольних тварин є фактором, який індукує збільшення частоти мікроядер в еритроцитах кісткового мозку, через те, що викликає стрес [19]. Таким чином, незважаючи на підвищення фонових значень кількості ПХЕ з мікроядрами референтний генотоксикант викликав суттєве підвищення індукції мікроядер у ПХЕ, тому обрана експериментальна модель на мишах С57BL придатна для вивчення генотоксичності.

Механізм утворення мікроядер під впливом Циклофосфану полягає у порушенні структури ДНК при взаємодії його метаболітів із нуклеотидами. Такі порушення призводять до розриву хромосом — кластогенний ефект. Але існує інший, опосередкований, механізм генотоксичності речовин — через їх взаємодію або їхніх метаболітів із білками, які забезпечують функціонування геному — анеугенний ефект. Саме до таких речовин належить карбендазим [20–21]. На відміну від Циклофосфану карбендазим блокує полімеризацію білка тубуліну, який бере участь в утворенні веретена поділу під час мітозу. Відомо, що карбендазим здатен індукувати мікроядра у ПХЕ за умов однократного внутрішньошлункового введення у надвеликих дозах — понад 1646 мг/кг, недіюча доза у цьому дослідженні — 66 мг/кг [20].

Іншими дослідженнями виявлено індукцію мікроядер у сперматодидах щурів за умов одноразового внутрішньошлункового введення у дозі 100 мг/кг [22]. Нашими попередніми дослідженнями встановлено цитотоксичний ефект у щурів і мишей за умов багаторазового внутрішньошлункового введення дози 75 мг/кг [23]. Тому дана доза була використана як максимально витривала для визначення чутливості моделі до таких генотоксикантів. Досліджено індукцію мікроядер у клітинах кісткового мозку — загальноприйнятого об’єкту при вивченні мутагенності [9] у мишей С57BL за умов надходження карбендазиму впродовж двох тижнів у дозі 75 мг/кг.

Карбендазим, як видно з таблиці 3, значно меншою мірою індукував мікроядра в ПХЕ. Кількість ПХЕ з мікроядрами була більшою тільки на 47,5 % (р≤0,05). Через значні коливання цього показника (коефіцієнт варіації 49,3 проти 34,0 у контролі) середня частота ПХЕ з мікроядрами, хоч і була в 1,5 раза більшою, але ефект був статистично не достовірним. Слід зауважити, що дана доза карбендазиму виявилася цитотоксичною для клітин кісткового мозку, про що свідчить статистично достовірне зменшення співвідношення поліхроматофільних до нормохромних еритроцитів. Таким чином, на даній моделі генотоксичний ефект карбендазиму в клітинах кісткового мозку не проявляється, що збігається із даними літератури [17, 20–22].

Таблиця 3

Результати оцінки генотоксичної активності ципроконазолу в клітинах кісткового мозку мишей в мікроядерному тесті

Узагальнені результати визначення гено-токсичності ципроконазолу за допомогою мікроядерного тесту у клітинах кісткового мозку мишей-самців С57BL представлені в таблиці 3. В ефективній дозі, яка при надходженні до організму викликає розвиток пухлин, 50 мг/кг, ципроконазол індукував збільшення кількості ПХЕ з мікроядрами на 46% (р≥0,05), але статистично незначиме через велике коливання індивідуальних показників (коефіцієнт варіації 53,1 проти 34 %% у контрольній групі). Вказана доза не чинила токсичного впливу на гемопоез, про що свідчить однакове з контролем співвідношення поліхроматофільних еритроцитів до нормохромних еритроцитів. У недіючій щодо онкогенного ефекту дозі, 2,5 мг/кг, ципроконазол не індукував збільшення кількості й частоти ПХЕ з мікроядрами.

Таким чином, генотоксичного ефекту Ципроконазолу у мікроядерному тесті на клітинах кісткового мозку мишей не виявлено.

Відомо, що особливості проявів канцерогенних ефектів залежить як від виду лабораторних тварин, так і від органу-мішені, що пов’язано з особливостями метаболічних перетворень проканцерогенів до їх кінцевих активних метаболітів, що зумовлюють генотоксичний ефект. Деякі канцерогени, зокрема нітрозаміни, не викликають генотоксичний ефект у мікроядерному тесті на клітинах кісткового мозку через те, що активні метаболіти, які утворюються в печінці, мають короткий час існування і не досягають клітин-мішеней [18]. Визначення ініціюючих властивостей ципроконазолу щодо гепатоканцерогенезу у мишей проведено за допомогою мікроядерного тесту.

Узагальнені результати цих досліджень на гепатоцитах мишей-самців С57BL представлені в таблиці 4.

Таблиця 4

Результати оцінки генотоксичної активності ципроконазолу в клітинах кісткового мозку мишей в мікроядерному тесті

Одержані дані, що наведені в таблиці 4, свідчать про збільшення клітин з мікроядрами в експериментальних групах мишей, які отримували карбендазим та ципроконазол у дозі 50 мг/кг, відносно контролю на 43,4 і 28,6 %% відповідно. Статистичний аналіз результатів за допомогою як параметричного критерію Стьюдента, так і непараметричних критеріїв χ2 та Манна-Уітні не виявив достовірного збільшення кількості клітин з мікроядрами у жодній із експериментальних груп порівняно з негативним контролем.

Відсутність достовірних змін у позитивному контролі поставив під сумнів можливість використання даної моделі для визначення генотоксичності вивчаємих речовин на гепатоцитах, тому був поставлений додатковий експеримент на цій моделі з використанням в якості позитивного контролю генотоксичного гепатоканцерогена — нітрозодіетиламіну. Клінічних ознак токсичного впливу речовини не виявлено. Після гепатектомії через післяопераційні ускладнення загинуло двоє мишей у контрольній групі і одна у дослідній. Результати експерименту наведені у таблиці 5.

Таблиця 5

Вплив нітрозодіетиламіну на індукцію мікроядер у гепатоцитах мишей

Кількість гепатоцитів з мікроядрами у мишей, яким вводився нітрозодіетиламін, достовірно перевищувала показники контролю (р≤0,05). Частота гепатоцитів з мікроядрами також статистично достовірно збільшувалась у 2,3 раза.

Таким чином, за допомогою даної моделі добре виявляється гепатоканцероген, який порушує структуру ДНК. Ураховуючи те, що результати по виявленню гепатоцитів з мікроядрами у контрольних мишей наведеного експерименту збігаються з даними, отриманими у контрольних тварин попереднього досліду, ми об’єднали дані обох дослідів у загальну контрольну групу з метою підвищення репрезентативності статистичної оцінки результатів попереднього досліду, яка наведена в таблиці 3. За допомогою такого підходу доведено достовірність індукції мікроядер у гепатоцитах карбендазимом. Збільшення частоти гепатоцитів з мікроядрами в печінці мишей під впливом ципроконазолу в дозі 50 мг/кг було статистично недостовірним.

Таким чином, ципроконазол в умовах проведеного експерименту не проявив генотоксичних властивостей. Показано, що введення ципроконазолу самцям мишей лінії С57ВL/6J у дозі 40,8 мг/кг протягом двох тижнів підвищує в гепатоцитах експресію множинних ізоформ цитохром Р-450 (CYP) залежних ферментів, а також інших ензимів, які метаболізують ксенобіотики [2]. Така модифікація метаболізму не призводить до накопичення сталих порушень геному, які б виявились під час активації проліферації гепатоцитів.

Статистично достовірного генотоксичного ефекту не виявлено на клітинах кісткового мозку мишей С57ВL/6J при надходженні упродовж двох тижнів ципроконазолу в дозі 50 мг/кг. Отриманий результат свідчить про те, що за цей період стабільних генотоксичних метаболітів ципроконазолу в печінці, які б викликали віддалені ефекти, не утворюється.

Проте наявність статистично недостовірного зростання кількості як гепатоцитів із мікроядрами, так і ПХЕ з мікроядрами не виключає можливості утворення незначної кількості генотоксикантів за даних умов. Це може бути наслідком змін у генах окисного стресу, розвитком некрозу гепатоцитів і відповідно пероксидації ліпідів із генерацією вільних радикалів або накопиченням спонтанних мутацій у клітинах у результаті активації пропроліферативних і антиапоптотичних генів. Виявлена кореляція (коефіцієнт кореляції 98,5 %; р≤0,05) між показниками частоти ПХЕ і гепатоцитів з мікроядрами свідчить про системний характер впливу карбендазиму і ципроконазолу на організм, а також про відсутність впливу модифікації метаболізму у гепатоцитах на генотоксичність ципроконазолу.

Результати проведених експериментів підтримують існуючу гіпотезу щодо рецепторного механізму канцерогенної дії коназолів і ципроконазолу, зокрема: ципроконазол або йогометаболіти в умовах in vivo взаємодіють із конституційним андрогенним рецептором (СAR), який запускає транскрипцію близько 300 генів, серед них CYP2b, який забезпечує метаболізм ксенобіотиків, Gadd45β — пропроліферативний і антиапоптотичний ген та інші. Наслідком цього є гепатомегалія, гіпертрофія і некроз гепатоцитів, зниження вмісту холестерину, трансретиноїдних кислот та підвищення проліферації гепатоцитів. Зростання проліферативної активності на тлі гальмування апоптозу призводить до накопичення спонтанно трансформованих клітин, з яких формуються клони, гіперпластичні вузлики і в решті-решт — пухлини за типовим епігенетичним механізмом канцерогенезу [2].

ЛІТЕРАТУРА

1. Toxicity profiles in mice treated with hepatotumorigenic and non–hepatotumorigenic triazole conazole fungicides: Propiconazole, triadimefon, and myclobutanil/ J.W. Allen, D.C. Wolf, M.H. George [et al.]// Toxicol Pathol. – 2006. – №34,7. – P. 853–862.

2. Mouse Liver Effects of Cyproconazole, a Triazole Fungicide: Role of the Constitutive Androstane Receptor / R.C. Peffer, J.G. Moggs, T. Pastoor [et al.] //Toxicol Sci. – 2007– №99,1. – Р. 315–325.

3. The hepatocarcinogenic conazoles: cyproconazole, epoxiconazole, and propiconazole induce a common set of toxicological and transcriptional responses. / S. Hester, T. Moore, W.T. Padgett [et al.] //Toxicol Sci. – 2012 – №127,1. – P. 54–65.

4. Concordance of transcriptional and apical benchmark dose levels for conazole-induced liver effects in mice / V.S. Bhat, S.D. Hester, S. Nesnow, D.A. Eastmond // Toxicol Sci. – 2013. – №136, 1. – P. 205–215.

5. Dose-response involvement of constitutive androstane receptor in mouse liver hypertrophy induced by triazole fungicides. / K. Tamura, K. Inoue, M. Takahashi [et al.] // Toxicol Lett. – 2013. – №221, 1. –.P. 47–56.

6. OECD Carcinogenicity Studies. Test Guideline 451, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Paris. 2009. – 15p.

7. OECD, Guidance Document 116 on the Conduct and Design of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453. – 2nd Edition , Series on Testing and Assessment, Paris, OECD. – 2012. – 156 р.

8. USEPA Guidelines for Carcinogen Risk Assessmen, Risk Assessment Forum, U.S.Environmental Protection Agency, Washington, DC, USA –2005.

9. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: Health Effects Test No. 474: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test // OECD, Paris. – 1997.

10. Eastmond D.A. Mutagenicity testing for chemical risk assessment: update of the WHO/IPCS Harmonized Scheme/ D.A. Eastmond, A. Hartwig, D. Anderson // Mutagenesis – 2009. – №24, 4. – Р. 341–349

11. Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом/ Л.П. Сычева, В.С. Журков [и др.] //Метод. рекомендации. – Москва. – 2001 12. Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях / Ред. Ю.А. Рахманин, Л.П. Сычева. – М.: Гениус, 2007. 312 с.

13. Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing./ A. Rothfuss, M. Honma, A. Czich [et al.] // Mutat Res. –2011. – №723, 2. – Р. 108 –120

14. Structural and numerical chromosome aberration inducers in liver micronucleus test in rats with partial hepatectomy./ S. Ito, C Hattori, M. Nagata, A. Sanbuissho [et al.] //Mutat Res. –2012. – 747, 1. – Р. 98–103.

15. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for experimental and other scientific purposes. Strasbourg: Council of Europe. – 1986. – 51 p.

16. IPCS. Environmental Health Criteria 149. Carbendazim. – WHO, 1993. – 132 p.

17. A survey of EPA/OPP and open literature on selected pesticide chemicals III. Mutagenicity and carcinogenicity of benomyl and carbendazim / M.E. McCarroll [et al.] // Mutation Research – 2002. – №512. – Р. 1–35.

18. Persistence of preclastogenic damage in hepatocytes of rats exposed to ethylnitrosourea, diethylnitrosamine, dimethylnitrosamine and methyl methanesulphonate. Correlation with DNA O-alkylation. / A.D. Tates, I. Neuteboom, A.H. Rotteveel [et al.] // Carcinogenesis. – 1986. – №7. – Р. 1053–1058.

19. Ингель Ф. И. Модификация эмоциональным стрессом мутагенных эффектов ксенобиотиков у животных и человека / Ф.И. Ингель, Ю.А. Ревазова // Исследования по генетике. Вып. 12. – СПб.: Изд–во С. –Петерб. ун-та, – 1999. – С. 86–103.

20. Evaluation of benomyl and carbendazim in the in vivo aneuploidy/micronucleus assay in BDF1 mouse bone marrow / A.M. Sarrif, K.S. Bentley, L.J. Fu [et al.] // Mutat Res. – 1994. – 310,1. – Р. 143–149.

21. Cytogenetic effects of benzimidazoles in mouse bone marrow /R. Barale, С. Scapoli, С. Meli [et al.] // Mutat Res. –1993. – 300, 1. – Р. 15–28.

22. Fusako Matsuo The Fungicide Carbendazim Induces Meiotic Micronuclei in the Spermatids of the Rat Testis / Matsuo Fusako, Nakai Masaaki and Nasu Tetsuo // J. Vet. Med. Sci. – 1999. – №61,5. – Р. 573–576

23. Лісовська В.С. Вплив карбендазиму на органи репродуктивної системи самців в умовах хронічного експерименту / В.С. Лісовська // IV міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених: Матеріали конгресу 21-23 травня 2002 року. – Тернопіль, 2002, Україна.

 

REFERENCES

1. Toxicity profiles in mice treated with hepatotumorigenic and non–hepatotumorigenic triazole conazole fungicides: Propiconazole, triadimefon, and myclobutanil/ J.W. Allen, D.C. Wolf, M.H. George [et al.]// Toxicol Pathol. – 2006. – №34,7. – P. 853–862.

2. Mouse Liver Effects of Cyproconazole, a Triazole Fungicide: Role of the Constitutive Androstane Receptor / R.C. Peffer, J.G. Moggs, T. Pastoor [et al.] //Toxicol Sci. – 2007– №99,1. – Р. 315–325.

3. The hepatocarcinogenic conazoles: cyproconazole, epoxiconazole, and propiconazole induce a common set of toxicological and transcriptional responses. / S. Hester, T. Moore, W.T. Padgett [et al.] //Toxicol Sci. – 2012 – №127,1. – P. 54–65.

4. Concordance of transcriptional and apical benchmark dose levels for conazole-induced liver effects in mice / V.S. Bhat, S.D. Hester, S. Nesnow, D.A. Eastmond // Toxicol Sci. – 2013. – №136, 1. – P. 205–215.

5. Dose-response involvement of constitutive androstane receptor in mouse liver hypertrophy induced by triazole fungicides. / K. Tamura, K. Inoue, M. Takahashi [et al.] // Toxicol Lett. – 2013. – №221, 1. –.P. 47–56.

6. OECD Carcinogenicity Studies. Test Guideline 451, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Paris. 2009. – 15p.

7. OECD, Guidance Document 116 on the Conduct and Design of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453. – 2nd Edition , Series on Testing and Assessment, Paris, OECD. – 2012. – 156 р.

8. USEPA Guidelines for Carcinogen Risk Assessmen, Risk Assessment Forum, U.S.Environmental Protection Agency, Washington, DC, USA –2005.

9. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: Health Effects Test No. 474: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test // OECD, Paris. – 1997.

10. Eastmond D.A. Mutagenicity testing for chemical risk assessment: update of the WHO/IPCS Harmonized Scheme/ D.A. Eastmond, A. Hartwig, D. Anderson // Mutagenesis – 2009. – №24, 4. – Р. 341–349

11. Ocenka mutagennoj aktivnosti faktorov okruzhayuschej sredy v kletkakh raznykh organov mlekopitayuschikh mikroyadernym metodom/ L.P. Sycheva, V.S. Zhurkov [i dr.] //Metod. rekomendacii. – Moskva. – 2001 12. Poliorgannyj mikroyadernyj test v ekologo-gigienicheskikh issledovaniyakh / Red. Yu.A. Rakhmanin, L.P. Sycheva. – M.: Genius, 2007. 312 s.

13. Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing./ A. Rothfuss, M. Honma, A. Czich [et al.] // Mutat Res. –2011. – №723, 2. – Р. 108 –120

14. Structural and numerical chromosome aberration inducers in liver micronucleus test in rats with partial hepatectomy./ S. Ito, C Hattori, M. Nagata, A. Sanbuissho [et al.] //Mutat Res. –2012. – 747, 1. – Р. 98–103.

15. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for experimental and other scientific purposes. Strasbourg: Council of Europe. – 1986. – 51 p.

16. IPCS. Environmental Health Criteria 149. Carbendazim. – WHO, 1993. – 132 p.

17. A survey of EPA/OPP and open literature on selected pesticide chemicals III. Mutagenicity and carcinogenicity of benomyl and carbendazim / M.E. McCarroll [et al.] // Mutation Research – 2002. – №512. – Р. 1–35.

18. Persistence of preclastogenic damage in hepatocytes of rats exposed to ethylnitrosourea, diethylnitrosamine, dimethylnitrosamine and methyl methanesulphonate. Correlation with DNA O-alkylation. / A.D. Tates, I. Neuteboom, A.H. Rotteveel [et al.] // Carcinogenesis. – 1986. – №7. – Р. 1053–1058.

19. Ingel' F. I. Modifikaciya emocional'nym stressom mutagennykh effektov ksenobiotikov u zhivotnykh i cheloveka / F.I. Ingel', Yu.A. Revazova // Issledovaniya po genetike. Vyp. 12. – SPb.: Izd–vo S. –Peterb. un-ta, – 1999. – S. 86–103.

20. Evaluation of benomyl and carbendazim in the in vivo aneuploidy/micronucleus assay in BDF1 mouse bone marrow / A.M. Sarrif, K.S. Bentley, L.J. Fu [et al.] // Mutat Res. – 1994. – 310,1. – Р. 143–149.

21. Cytogenetic effects of benzimidazoles in mouse bone marrow /R. Barale, С. Scapoli, С. Meli [et al.] // Mutat Res. –1993. – 300, 1. – Р. 15–28.

22. Fusako Matsuo The Fungicide Carbendazim Induces Meiotic Micronuclei in the Spermatids of the Rat Testis / Matsuo Fusako, Nakai Masaaki and Nasu Tetsuo // J. Vet. Med. Sci. – 1999. – №61,5. – Р. 573–576

23. Lisovs'ka V.S. Vplyv karbendazymu na organy reproduktyvnoi systemy samciv v umovakh khronichnogo eksperymentu / V.S. Lisovs'ka // IV mizhnarodnyj medychnyj kongres studentiv i molodykh vchenykh: Materialy kongresu 21-23 travnya 2002 roku. – Ternopil', 2002, Ukraina.