Пригнічення проліферативної активності злоякісних клітин залишається сьогодні однією з основних стратегій у протипухлинній терапії [1]. Проте найбільшим обмеженням для протипухлинних засобів є висока токсичність щодо нормальних клітин.
Незначні побічні ефекти нових інгібіторів тирозинкіназ похідного малеїміду 1-(4-Cl-бензил)-3-Cl-4-(CF3-феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діону (МІ-1) та похідного дигідропіролу 1,4-заміщеного 5-аміно-1,2-дигідропірол-3-ону (Д-1) у порівнянні з іншими цитостатиками стали аргументом на користь їхнього дослідження як потенційних протипухлинних препаратів. У дослідах на тваринах було виявлено, що МІ-1 і Д-1 мають низьку токсичність щодо органів та тканин інтактних щурів (табл. 1). Про ефективність сполук свідчить їхня здатність у концентраціях 10-100 мкмоль/л пригнічувати проліферацію та ріст деяких трансформованих і злоякісних клітин людини на 80-90%. МІ-1 найефективніше пригнічує клітини аденокарциноми кишечнику SW-620, карциноми молочної залози MCF7, меланоми UACC-62, лейкемії SR, недрібноклітинного раку легень A-549 [2], Д-1 клітини еритролейкемії К-562, лімфобластної лейкемії CCRF-CEM, карциноми молочної залози МDA-MB-435, аденокарциноми товстої кишки HCT-15 та нейробластоми SNB-75 [3]. Інгібування росту нормальних фібробластів і ендотеліоцитів під впливом МІ-1 відбувається лише на 20-30% [2, 4].
Водночас ефекти обох сполук на клітинні функції були досліджені недостатньо і механізми, що лежать в основі антипроліферативної активності сполук, залишаються нез'ясованими. Тому використання альтернативних методів у подальших дослідженнях на культурах клітин вкрай необхідне.
Мета нашої роботи — дослідження життєздатності та внесок апоптозу в клітинну загибель клітин аденокарциноми яєчників лінії SK-OV-3 під впливом нових потенційних протипухлинних сполук МІ-1 та Д-1.
Матеріали та методи дослідження
У дослідженнях використана комерційна лінія клітин SK-OV-3 (American Type Culture Collection, Rockvill, USA). Клітини були культивовані в середовищі DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) (Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, USA). До середовищ культивування додавали 10% ембріональної сироватки бика (fetal bovina serum, FBS), стрептоміцин (50 мкг/мл) і пеніцилін (100 од/мл). Всі культури підтримували при 37оС в атмосфері, що містить 5% СО2, середовище змінювали кожні 3 дні, всі експерименти здійснювали між третім і шостим пасажем.
Визначення життєздатності та оцінку проліферативної активності життєздатних клітин проводили з використанням 3,4,5-диметилтіазол-2-іл-2,5-дифеніл-тетразоліум бромід (МТТ)-тесту, в основі якого лежить здатність мітохондрій живих клітин відновлювати тетразолієву сіль МТТ до МТТ-формазану [14]. Клітини були розсіяні в 500 мл МЕМ з 10% FBS зі щільністю 2х104 клітин/лунку в 24-лункові планшети. Після 24 годин середовище в експериментальних лунках було замінене на відповідне з 1% FBS та досліджуваними концентраціями (1, 3 та 10 мкмоль/л) МІ-1 і Д-1 та в контрольних лунках без цих сполук. Кожна група містила 6 різних лунок. Після 24 годин клітинна життєздатність була оцінена за допомогою МТТ-тесту, який проводили згідно з інструкцією виробника (Sigma, St Louis, МО).
Таблиця 1
Загальна токсичність МІ-1 і Д-1 на тканини та органи щурів
Дослідження клітиної загибелі шляхом апоптозу та некрозу проводили за допомогою проточної цитометрії після фарбування клітин специфічними антитілами з флюоресцентною міткою до анексину V (Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I, BD Pharmitrogen), що специфічно зв'язується з фосфатидилсерином на клітинній поверхні та пропідіум йодидом, що є маркером мертвих клітин [15]. Транслокація фосфатидилсерину з внутрішньої сторони плазматичної мембрани на зовнішню є однією з найбільш ранніх подій апоптозу. Клітини розсіювали в 6-лункові планшети в кількості 0,7х106 клітин/лунку в 3 мл середовища без сироватки та інкубували 24 години з МІ-1 та Д-1 в концентраціях 1 і 10 мкмоль/л.
Дані представлені як М±SD, де М — середнє значення, SD-стандартне відхилення. Після підтвердження нормального розподілу всіх даних за допомогою тесту Колмогорова-Смірнова, статистично значима різниця між дослідними групами і контролем була проаналізована з використанням t-тесту Стьюдента. Аналіз даних представлений з використанням статистичної програми SPSS 14.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Різниця між дослідними групами і контролем вважалась статистично значимою при P < 0,05.
Одержані результати та їх обговорення
За результатами МТТ-тесту після 24 годин впливу МІ-1 встановлено незначну концентраційну залежність пригнічення життєздатності клітин лінії SK-OV-3. Вона зменшується від 53% до 38% у досліджуваному діапазоні. Для Д-1 кількість життєздатних клітин становила 45-47% незалежно від концентрації (рис. 1). Тобто антипроліферативна здатність обох сполук приблизно однакова для клітин аденокарциноми яєчників цієї лінії.
Рис. 1. Ефект МІ-1 та Д-1 на життєздатність клітин лінії SK-OV-3 після 24 годин впливу.
Клітини, що не підлягали впливу сполук, були взяті за контроль. Значення оптичної густини (od) при різних концентраціях були нормалізовані з середнім значенням оптичної густини контролю (od контролю=1). Значення представлені як М±SD (SD-стандартне відхилення).* — р<0,05 по відношенню до контролю.
Для отримання більш детальної інформації про вплив на життєздатність клітин лінії SK-OV-3 та внесок у клітинну загибель апоптозу та некрозу було проведене дослідження з використанням специфічних антитіл до алексину V. Встановлено, що в контролі кількість життєздатних клітин становила 74%, під впливом МІ-1 в обох концентраціях їх кількість меншилась до 27-33%, а під впливом Д-1 до 12%. Тобто цитотоксичність по відношенню до клітин даної лінії вища для Д-1, оскільки кількість життєздатних під його впливом менша, ніж під впливом МІ-1 (рис. 2).
Рис. 2. Співвідношення життєздатних клітин, клітин на ранній стадії апоптозу, загиблих шляхом апоптозу і некрозу лінії SK-OV-3 після впливу МІ-1 та Д-1 протягом 24 годин.
Кількість клітин у ранній стадії апоптозу є незначною як у контролі (3%), так і під дією обох сполук (5-6%). МІ-1 не впливає на кількість некротизованих клітин, тоді як під дією Д-1 їх частка зростає з 1% у контролі до 5%. Більшість клітин (до 70% під впливом МІ-1 і до 80% під впливом Д-1) загинули шляхом апоптозу. На рисунку 3 представлено результати, отримані на проточному цитометрі для клітин, що не зазнавали впливу (контроль) і після 24-годинного впливу МІ-1 та Д-1 у концентрації 10 мкмоль/л.
Таким чином, хоча за результатами МТТ-тесту антипроліферативна здатність обох сполук була майже однакова і становила 50-60%, однак дослідження шляхів клітинної загибелі дозволило встановити більшу цитотоксичність Д-1, оскільки виживання клітин під його дією за результатами тесту на апоптоз становило лише 12%. А для МІ-1 за тих же умов виживання — 27-33%. Д-1 є більш перспективною сполукою для подальших досліджень ефективної терапії аденокарциноми яєчників. Одержані дані свідчать, що одним з можливих механізмів протипухлинної активності обох сполук є активація апоптотичного шляху клітинної загибелі.
Рис. 3. Результати дослідження апоптозу клітин лінії SK-OV-3, одержані на проточному цитометрі для контролю (А), МІ-1 (Б) та Д-1 (В) в концентрації 10 мкмоль/л.
Анексин V (A) є маркером ранньої стадії апоптозу, пропідіум йодид (P) — маркер загиблих клітин шляхом некрозу. А-Р — живі клітини; А+Р — клітини на ранній стадії апоптозу; А-Р+ — мертві клітини, що загинули шляхом некрозу; А+ Р+ — пізній апоптоз.
Висновки
1. Цитотоксичність Д-1 по відношенню до клітин аденокарциноми яєчників лінії SK-OV-3 є більшою порівняно з МІ-1.
2. Активація апоптозу залучена до механізмів протипухлинної активності обох сполук.
3. Сполуки МІ-1 та Д-1 є перспективними для терапевтичного застосування при аденокарциномі яєчників.
Робота виконана у рамках НДР "Молекулярні механізми протипухлинної активності нового похідного малеїміду" (№ держреєстрації 0111U005413).
ЛІТЕРАТУРА
1. Hirsch J. An anniversary for cancer chemotherapy / J. Hirsch // JAMA. — 2006. — V. 296. — P. 1518—1520
2. Антипроліферативна дія нових похідних 1-(4-R-бензил)-3-R1-4-(R2-феніламіно)-1H-пірол-2,5-діону / Г. Г. Дубініна, С.М. Головач, В.О. Козловський, А.О. [та ін.]// Журнал орг. та фармацевт. хімії. — 2007. — Вип. 5, №1. — С. 39—49.
3. Дубініна Г.Г. Сполука 1,4-заміщених 5-аміно-1,2-дигідропірол-3-онів, що має протиракову активність / Г. Г. Дубініна, Ю.М. Воловенко // Патент № 22204 UA від 25.04.2007.
4. Antiproliferative effects and influence on liver condition after per os administration of novel cytostatic maleimide derivate / S. Yablonska, O. Lynchak, O.Filinska [et al.] // FEBS Journal "Life's molecular interactions: 34 th FEBS Congress". — 2009. — Vol. 276. — P.352.
5. Морфофункціональний стан органів шлунково-кишкового тракту після впливу похідного малеїміду МІ-1 протягом місяця / О.В. Линчак, І.В. Харчук, Н.О. Карпезо, Г.В. Островська, В.К. Рибальченко// Современные проблемы токсикологии. — 2011. — № 1-2. — С.52—55.
6. Харчук І.В. Особливості впливу різних термінів введення потенційного протипухлинного засобу — похідного малеїміду на стан сперматогенного епітелію щурів / І.В. Харчук, В.К. Рибальченко // Вісник Луганського національного університету ім. Тараса Шевченка. 2010. — № 24(211) грудень. — С. 94—98.
7. Порівняння впливу цитостатичних сполук похідного дигідропіролу і 5-фторурацилу на слизову оболонку кишечника щурів / [Г.М. Кузнєцова, Г.В. Островская, В.К. Рыбальченко] // Современные проблемы токсикологии. — 2011. — №1-2. — C.47—51.
8. Дослідження впливу похідного малеїміду 1-(4-Cl-бензил)-3-хлор-4-(CF3-феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діону на морфологічний стан печінки / О.В. Линчак, І.В. Харчук, Г.В. Островська [et al.] // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Збір. наук. праць. — Київ-Луганськ-Харків. — 2007. — Випуск 3—4 (78-79). — С. 34—39.
9. Оцінка гепатотоксичності нового похідного малеїміду з цитостатичною активністю і його вплив на перекисне окислення та антиоксидантну систему печінки / С.В. Яблонська, О.М. Філінська, Г.В. Островська, В.К. Рибальченко // Укр. біохім. журн. — 2009. — Т.81, №3. — С. 83—92.
10. Особливості морфофункціонального стану нирок під впливом різних доз та тривалості дії потенційного цитостатика похідного малеїміду 1-(4-Cl-бензил)-3-Cl-4-(CF3-феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діону / І.В. Харчук, Н.О. Карпезо, Г.В. Островська [та ін.] // Доп. НАН України. — 2009, № 10. — С. 185—188.
11. Столяр О.С. Вивчення кардіотоксичних властивостей цитостатичної сполуки похідного дигідропіролу за умов оксидативного стресу / О.С. Столяр // Матер. конф. молод. науковців "Від молекули до біосфери", Харків, 22-25 листопада 2011р. — С.216—217.
12. Харчук І.В. Реакція міокарда щурів на тривалий вплив похідного малеїміду потенційного протипухлинного засобу / І.В. Харчук, В.К. Рибальченко // Вісник проблем біології і медицини. — 2011. — Т. 2, Вип 2. — С. 282—285.
13. Effect of the maleimide derivative MI-1, a novel antitumor agent, on the rat myocardium and cardiomyocytes / V. Rybalchenko, I. Kharchuk, V. Kyrychenko, O. Lynchak // Exp. Clin. Cardiol. — 2011. — V. 16, Suppl A 2011. — P. 25A.
14. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays / T. Mosmann // J Immunol Meth. — 1983. — V.65. — P.55-63.
15. The proliferation and differentiation of osteoblasts in co-culture with human umbilical vein endothelial cells: An improved analysis using fluorescence-activated cell sorting / Yu Zhang, A. Schedle, M. Matejka [et al.] // Cell Mol Biol Lett. — 2010. V15, №4. — Р. 517 529.
REFERENCES
1. Hirsch J. An anniversary for cancer chemotherapy / J. Hirsch // JAMA. — 2006. — V. 296. — P. 1518—1520
2. Antyproliferatyvna diya novykh pokhidnykh 1-(4-R-benzyl)-3-R1-4-(R2-fenilamino)-1H-pirol-2,5-dionu / G. G. Dubinina, S.M. Golovach, V.O. Kozlovs'kyj, A.O. [ta in.]// Zhurnal org. ta farmacevt. khimii. — 2007. — Vyp. 5, №1. — S. 39—49.
3. Dubinina G.G. Spoluka 1,4-zamischenykh 5-amino-1,2-dygidropirol-3-oniv, scho mae protyrakovu aktyvnist' / G. G. Dubinina, Yu.M. Volovenko // Patent № 22204 UA vid 25.04.2007.
4. Antiproliferative effects and influence on liver condition after per os administration of novel cytostatic maleimide derivate / S. Yablonska, O. Lynchak, O.Filinska [et al.] // FEBS Journal "Life's molecular interactions: 34 th FEBS Congress". — 2009. — Vol. 276. — P.352.
5. Morfofunkcional'nyj stan organiv shlunkovo-kyshkovogo traktu pislya vplyvu pokhidnogo maleimidu MI-1 protyagom misyacya / O.V. Lynchak, I.V. Kharchuk, N.O. Karpezo, G.V. Ostrovs'ka, V.K. Rybal'chenko// Sovremennye problemy toksykologyy. — 2011. — № 1-2. — S.52—55.
6. Kharchuk I.V. Osoblyvosti vplyvu riznykh terminiv vvedennya potencijnogo protypukhlynnogo zasobu — pokhidnogo maleimidu na stan spermatogennogo epiteliyu schuriv / I.V. Kharchuk, V.K. Rybal'chenko // Visnyk Lugans'kogo nacional'nogo universytetu im. Tarasa Shevchenka. 2010. — № 24(211) gruden'. — S. 94—98.
7. Porivnyannya vplyvu cytostatychnykh spoluk pokhidnogo dygidropirolu i 5-ftoruracylu na slyzovu obolonku kyshechnyka schuriv / [G.M. Kuznecova, G.V. Ostrovskaya, V.K. Rybal'chenko] // Sovremennye problemy toksykologyy. — 2011. — №1-2. — C.47—51.
8. Doslidzhennya vplyvu pokhidnogo maleimidu 1-(4-Cl-benzyl)-3-khlor-4-(CF3-fenilamino)-1N-pirol-2,5-dionu na morfologichnyj stan pechinky / O.V. Lynchak, I.V. Kharchuk, G.V. Ostrovs'ka [et al.] // Problemy ekologichnoi ta medychnoi genetyky i klinichnoi imunologii. Zbir. nauk. prac'. — Kyiv-Lugans'k-Kharkiv. — 2007. — Vypusk 3—4 (78-79). — S. 34—39.
9. Ocinka gepatotoksychnosti novogo pokhidnogo maleimidu z cytostatychnoyu aktyvnistyu i jogo vplyv na perekysne okyslennya ta antyoksydantnu systemu pechinky / S.V. Yablons'ka, O.M. Filins'ka, G.V. Ostrovs'ka, V.K. Rybal'chenko // Ukr. biokhim. zhurn. — 2009. — T.81, №3. — S. 83—92.
10. Osoblyvosti morfofunkcional'nogo stanu nyrok pid vplyvom riznykh doz ta tryvalosti dii potencijnogo cytostatyka pokhidnogo maleimidu 1-(4-Cl-benzyl)-3-Cl-4-(CF3-fenilamino)-1N-pirol-2,5-dionu / I.V. Kharchuk, N.O. Karpezo, G.V. Ostrovs'ka [ta in.] // Dop. NAN Ukrainy. — 2009, № 10. — S. 185—188.
11. Stolyar O.S. Vyvchennya kardiotoksychnykh vlastyvostej cytostatychnoi spoluky pokhidnogo dygidropirolu za umov oksydatyvnogo stresu / O.S. Stolyar // Mater. konf. molod. naukovciv "Vid molekuly do biosfery", Kharkiv, 22-25 lystopada 2011r. — S.216—217.
12. Kharchuk I.V. Reakciya miokarda schuriv na tryvalyj vplyv pokhidnogo maleimidu potencijnogo protypukhlynnogo zasobu / I.V. Kharchuk, V.K. Rybal'chenko // Visnyk problem biologii i medycyny. — 2011. — T. 2, Vyp 2. — S. 282—285.
13. Effect of the maleimide derivative MI-1, a novel antitumor agent, on the rat myocardium and cardiomyocytes / V. Rybalchenko, I. Kharchuk, V. Kyrychenko, O. Lynchak // Exp. Clin. Cardiol. — 2011. — V. 16, Suppl A 2011. — P. 25A.
14. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays / T. Mosmann // J Immunol Meth. — 1983. — V.65. — P.55-63.
15. The proliferation and differentiation of osteoblasts in co-culture with human umbilical vein endothelial cells: An improved analysis using fluorescence-activated cell sorting / Yu Zhang, A. Schedle, M. Matejka [et al.] // Cell Mol Biol Lett. — 2010. V15, №4. — Р. 517 529.
Надійшла до редакції 9.04.2012 р.