У сучасній професійній токсикології та фармакології переважають методи дослідження хімічних речовин in vivo з використанням експериментальних тварин. Як підкреслювалося ще у 1991 р. на сесії загальних зборів АМН СРСР, а пізніше у доповідях ряду інших наукових форумів: "…досліди на тваринах залишаються в наш час найкращим, а часто єдиним допустимим методом виявлення токсичного ефекту. Зміни такої практики у майбутньому є маловірогідними" [1].
У той же час останніми роками все помітнішою стає тенденція до значного зростання використання в практиці токсикологічного експерименту дослідів in vitro. Необхідно підкреслити, що досить детально цей напрямок у токсикологічних дослідженнях був розглянутий і на чотирьох конгресах з біоетики, де особливо підкреслювалась виправданість широкого використання в токсикології методів in vitro [2].
З подальшим розвитком оцінки токсичності ксенобіотиків з використанням культур клітин головною проблемою залишається відповідність даних з токсичності речовин, отриманих in vitro, до реальної їх небезпеки для цілісного організму. Існують математичні моделі, за допомогою яких за показниками EС50 (ефективна концентрація речовини в поживному середовищі, що викликає загибель 50% клітин), отриманими в ізольованих культурах клітин in vitro, є можливість приблизно розрахувати ЛД50 для щурів [3]. Однак такі модельні системи не дають можливості скласти чітку уяву щодо впливу взаємозв`язків між окремими органами та системами на дію токсичної сполуки в умовах цілісного організму. Залишається неясним, чи збільшується цей вплив за рахунок більшої чутливості окремих органів та тканин, або зменшується за рахунок того, що менш чутливі органи та тканини приймають на себе токсичне навантаження. Існуючі експериментальні методи оцінки цитотоксичності речовин in vitro використовують такі моделі, як первинні культури клітин, постійні клітинні лінії, зрізи тканин або ж перфузовані ізольовані органи. Однак такі методики встановлення загальної цитотоксичності чинника доцільно використовувати лише з метою спрощеної оцінки його токсичного ефекту, який можна чекати in vivo [4, 5]. На сьогоднішній день у якості рутинних під час другого етапу токсикологічної перевірки косметичних засобів та деяких ліків вже використовуються методи оцінки токсичності in vitro з метою більш чіткого моделювання їхньої можливої токсичної дії in vivo. На завершальній стадії досліджень цю дію моделюють на тваринах і отримані дані екстраполюють на людину. Наведений вище підхід є найбільш визнаним на сьогодні для оцінки токсичності речовин, оскільки не існує інших моделей, які б повністю відповідали складній фізіології та біохімії живого організму [6]. Поряд з цим існує ще актуальна проблема видової специфічності токсикологічних реакцій клітин як in vitro, так й in vivo. Зокрема, нами було показано, що результати експериментів in vitro на клітинах тварин або in vivo на лабораторних тваринах не відповідають реальній токсичності ксенобіотиків для організму людини. Найбільш адекватними щодо реальної токсичності для людини in vivo є лише експерименти in vitro з використанням культур клітин людини, нормальних чи трансформованих [7]. У зв'язку з цим стає зрозумілим, що для заміни дослідів на тваринах необхідне створення таких клітинних систем in vitro, які б максимально відповідали умовам in vivo з врахуванням як видової, так і тканинної специфічності. Саме такий підхід забезпечить наявність факторів, критичних при проявах ефектів інтоксикації в цілісному організмі. Оскільки живий організм являє собою інтегровану систему взаємопозв`язаних між собою органів та тканин, є логічним, що саме ця взаємодія є основною у розумінні кінцевого змісту і прояву токсичного ефекту. Тому було б доцільно відтворити таку модель живого організму людини in vitro, яка б моделювала міжтканинну і міжорганну взаємодію. В цьому контексті привертає увагу система інтегрованих дискретних культур нормальних клітин кількох органів (IdMOC) і клітин раку молочної залози, запропонована Li A.P. із співавторами [8], яка була використана для дослідження комбінованої дії протипухлинних препаратів на нормальні та пухлинні клітини. Така система ко-культивації клітин відтворює одночасний вплив протипухлинного препарату не тільки на пухлину, а й на клітини деяких нормальних тканин. Ця система дає змогу спостерігати одночасний вплив на нормальні та пухлинні клітини як хіміопрепаратів, модифікованих міжорганною взаємодією, так й їхніх метаболітів, продуктів цитолізу клітин і таке ін. Недоліком запропонованої системи є дещо обмежений мультиорганний спектр нормальних клітин (гепатоцити, клітини нирки, легені, астроцити та ендотеліальні клітини), які вимагають дуже специфічних умов культивування і мають обмежений термін життя in vitro.
На наш погляд, така модель представляє інтерес не тільки для дослідження активності протипухлинних препаратів, а й для визначення впливу інших хімічних речовин в умовах in vitro. Базуючись на цій ідеї, ми розробили іншу просту модель in vitro для тестування токсичності хімічних сполук, засновану на використанні пухлинних клітин замість нормальних. Метою даної роботи було проаналізувати зміни показників токсичного впливу хімічних речовин у системі ко-культур органоспецифічних клітин в порівнянні з реакцією на токсичний вплив культур клітин, що культивуються окремо.
Матеріали та методи дослідження Культивування клітин. В експериментах були використані постійні клітинні лінії людини різного тканинного походження: лінія з недрібноклітинного раку легені — А-549, лінія з гепатоми — HepG2, клітини нейробластоми — лінія IMR-32, а також імморталізовані нормальні кератиноцити — лінія HaCaT. Клітини культивували в повному поживному середовищі RPMI 1640, що містило 4 ммоль/л L-глю-таміну, 10% ембріональної сироватки теляти, 40 мкг/мл гентаміцину ("SIGMA", США) у зволоженій атмосфері з 5% СО2 при 37°С. Заміну середовища проводили кожні 2 доби. Пересів клітин здійснювали за допомогою розчину версена при утворенні клітинами на субстраті суцільного моношару (4-5 доба росту). Всі клітинні лінії отримані з Клітинного Банку ліній з тканин людини та тварин ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України.
Цитотоксичні чинники. Як токсичні чинники використовували розчин хімічно чистих солей важких металів сульфат кадмію і сульфат марганцю у деіонізованій воді.
Фарбування МТТ [9]. Клітини висаджували на 96-лункові планшети в концентрації 1х105/мл по 100 мкл на лунку у повному ростовому середовищі. Через 24 години до клітин вносили розчин досліджуваних солей важких металів у різній концентрації. Через 24 годин культивування в середовище вносили барвник (3-[4,5-Dimetilthiazole-2-yl]-2,5-diphenylte-trazolium bromide; Thiazolyl blue) (SIGMA, США) по 10 мкл/лунку в концентрації 5 мг/мл на 3 години. Після цього планшет центрифугували (1500 об/хв протягом 5 хв.), видаляли супернатант й додавали в кожну лунку по 50 мкл DMSO (диметилсульфоксид; SERVA) для розчинення кристалів формазану. Через 30 хвилин інкубації при кімнатній температурі визначали оптичну густину (ОГ) вмісту лунок при довжині хвилі 540 нм за допомогою мульти-лункового спектрометру Мультискан (Швеція). В якості контролю використовували порожні лунки та лунки з клітинами, в які не додавали ксенобіотик. Дію кожної речовини досліджували у чотирьох повторах, кожний експеримент повторювали тричі. Статистичний аналіз, проведений за t-критерієм Стьюдента, достовірною різницею між показники вважали при рівні P<0,05.
Результати та їх обговорення
Як відомо, солі важких металів широко застосовуються в промисловості. Токсичність їх загальновідома, однак механізми цієї токсичності, тканинна вибірковість дії багатьох хімічних сполук залишається мало дослідженою. В цілому токсичність сполук при інтоксикації цілого організму визначається не тільки їх прямою дією на клітини-мішені, а й опосередкованою: при загибелі клітин відбувається значний викид безпосередньо у міжклітинний простір протеолітичних ферментів, ініціюються вільнорадикальні реакції, а з ними розвивається оксидативний стрес. В результаті цих процесів виділяються медіатори запалення та токсичні продукти клітинної деградації, що надалі доповнюють загальну картину токсикозу. Виходячи з цього, створення моделі загальної токсичності для клітин і тканин різних органів повинно забезпечити відтворення всіх згаданих процесів у системі in vitro. Використовуючи ідею системи IdMOC [8], ми створили свою спрощену модель мультиорганної системи токсичності (МОСТ), яка забезпечує міжорганний обмін на рівні гуморальних компонентів за рахунок системи каналів, що об'єднують клітинні об'єкти in vitro, але виключають їх фізичний контакт.
Згадана вище система IdMOC передбачає використання культур нормальних клітин різних органів, однак це створює, як вказувалось, багато труднощів. Разом з тим, відомо, що пухлинні клітини, залежно від рівня диференціювання, можуть певною мірою зберігати чутливість до хімічних сполук, характерну для їх нормальних прототипів. Наші попередні дослідження продемонстрували високий рівень відповідності ступеня токсичності хімічних сполук in vitro як для нормальних, так і пухлинних клітин різного гістогенезу ступеня токсичності цих сполук для організму людини [7]. Виходячи з цього, на прикладі сполук важких металів нами продемонстрована найбільш проста модель мультиорганної системи токсичності (МОСТ) на основі ко-культивування in vitro не нормальних, а трансформованих клітин. Перевагою такої системи МОСТ є простота у використанні та доступність клітинних об'єктів різного гістогенезу, їх достатньо висока популяційна та цито-генетична стабільність, можливість чітко стандартизувати умови експерименту, легко моделювати проліферативний статус культур, значно розширювати тканинний спектр окремих моделей з врахуванням метаболічних особливостей клітин. Автономність росту трансформованих клітин виключає необхідність використання специфічних і дорогих ростових компонентів, дія яких може змінювати реакцію клітин на хімічні та інші чинники. Використання описаної системи МОСТ дає можливість досліджувати такі параметри:
- одночасний метаболізм ксе-нобіотиків в клітинах різних органів;
- клітини-мішені, найбільш чутливі до дії даного ксенобіотика в умовах моделі МОСТ;
- міжклітинна взаємодія органів та систем;
- дія тканинно-специфічних факторів, що виділяються клітинами у відповідь на токсичний чинник;
- порівняльні показники токсичності в моделі, подібній до умов цілісного організму.
В основі реалізації моделі МОСТ лежить ко-культивування клітин у луночках планшет, які поєднані між собою отворами, що виключає можливість прямого контакту між клітинами різних тканин, однак дає можливість обмінюватись клітинам розчинними компонентами мікрооточення — факторами міжорганної взаємодії, тканинно-специфічними продуктами токсичної дії ксенобіотиків, їх метаболітами та ін.
При проведенні експерименту клітини висаджували в лунки 96-лункової планшети у концентрації 105/мл по 100 мкл/лунку. Дослідні луночки, об`єднані між собою за допомогою спеціально зроблених каналів, сполучаються між собою поживним середовищем з дослідною хімічною речовиною певної концентрації. Солі важких металів сульфати кадмію і марганцю використовували у концентрації, підібраній у попередніх експериментах з використанням різних клітинних ліній.
Базуючись на чутливості клітин різних тканин, за основу використовували концентрацію солей, що викликає загибель 50% клітин (ЕC50 — ефективна концентрація) нейробластоми IMR-32, що відрізняється відносно високою чутливістю до ксенобіотиків. Окрім нейробластоми в експериментах використовували гепатоцити (гепатома HepG2), клітини шкіри (кератиноцити лінії HaCaT) та прототип альвеоліцитів клітини аденокарциноми легені лінії A-549. Контролем служили клітини цих же ліній, які розміщували в ізольованих лунках з такою ж самою концентрацією чинника в поживному середовищі, як в досліді, а також інтактні клітини ізольовані або в об`єднаних лунках у відсутності чинників. Після інкубації клітин з хімічним чинником протягом 24 годин кожну лунку 96-лункового планшету фарбували МТТ за методикою, що вказана вище.
При вмісті в лунці сульфату кадмію у концентрації 0,025± 0,006 мг/мл (ЕC50) найбільш чутливими до цитотоксичної дії цієї сполуки виявились гепатоцити і нейробласти, а клітини легені та шкіри були відносно резистентними. При ко-культивуванні токсичність сульфату кадмію залишалась аналогічною для всіх ізольованих клітин, окрім кератиноцитів, чутливість яких достовірно зростала (табл. 1, рис. 1).
Таблиця 1
Порівняння показників цитотоксичної дії сульфату кадмію на клітини ізольованих та ко-культивованих культур різного гістогененезу (р<0,05)
Рис. 1 Порівняння показників цитотоксичної дії сульфату кадмію на клітини в ізольованих та в ко-культивованих культурах (р<0,05)
Зростання чутливості кератиноцитів можна пояснити тим, що у разі значного ураження печінки шкіра може частково брати на себе функцію детоксикації організму. В наших експериментах у системі МОСТ клітини шкіри, дійсно, прийняли на себе навантаження по боротьбі з токсинами як з сіллю кадмію, так і тими, що з`явилися в системі в результаті часткової загибелі та ураження клітин в інших культурах. Остаточно механізми виявленого нами феномену ще потребують детального аналізу, однак цікаво: одержані дані підтверджують результати недавніх досліджень [10] щодо вибіркової токсичність сполук кадмію саме для шкіри.
Для аналізу дії сульфату марганцю в ко-культурі також була використана концентрація солі, яка становить ЕС50 для нервових клітин IMR-32 (0,2±0,05 мг/мл), але є менш токсичною для клітин тканин інших органів. На відміну від сульфату кадмію, сульфат марганцю у вказаній концентрації викликав загибель 50±5% нервових клітин в ізольованих лунках, але тільки 29±4% клітин печінки.(табл. 2, рис. 2)
Таблиця 2
Порівняння показників цитотоксичної дії сульфату марганцю на клітини ізольованих та ко-культивованих культур різного гістогененезу (р<0,05)
Рис.2 Порівняння показників цитотоксичної дії сульфату марганцю на клітини в ізольованих та в ко-культивованих культурах (р<0,05).
У цьому експерименті виявляється тенденція, аналогічна тій, що спостерігалася у дослідах із сіллю кадмію — клітини одних тканин можуть зменшувати токсичне навантаження на більш чутливі клітини. У випадку з сіллю марганцю спостерігається незначне зниження життєздатності клітин легенів та шкіри, та помітне збільшення життєздатності клітин у культурах нервової тканини та печінки в ко-культурі порівняно з культурами клітин, що знаходились ізольовано. Очевидно, що більш стійки клітини легені та шкіри, життєздатність яких незначно знизилась у присутності використаної концентрації солі марганцю, розподілили міждетоксикаційну функцію, внаслідок чого гепатоцити змогли повністю подолати навантаження в системі та відновитися. Логічно, що зниження загальної токсичності у системі привело і до зростання життєздатності нервових клітин. Не дивлячись на те, що життєздатність клітин легені та шкіри в системі ко-культур незначно знизилась, в цілому стабільність системи в даному випадку зростає, життєздатність усіх клітин стала більшою 50% порівняно з контрольними культурами, де клітини знаходились ізольовано.
Таким чином, на прикладі солей важких металів нами продемонстрована нова клітинна модель МОСТ, яка дає змогу побачити реальні зміни в очікуваній токсичності ксенобіотиків в умовах міжорганної взаємодії. Така система мультиорганної токсичності in vitro дозволяє не тільки визначення змін у рівні токсичності речовин для клітин людини, але допускає й дослідження чинників, що можуть виконувати роль антидотів та їхню тканинну специфічність.
Висновки
1. Токсикологічні дослідження з використанням моделі мультиорганної системи токсичності (МОСТ) на етапі санітарно-гігієнічної експертизи та оцінки токсичності хімічних сполук дає можливість краще зрозуміти механізми взаємодії органів та систем цілісного організму при детоксикації хімічних речовин та більш коректно екстраполювати дані дослідів in vitro на організм людини.
2. Дослідження з використанням моделі МОСТ показали, що клітини шкіри і печінки є найбільш активними у прояві детоксикуючих функцій в умовах міжорганної взаємодії. Створена модельна система чітко доводить, що міжорганна взаємодія може суттєво впливати на кінцевий результат дії ксенобіотика в організмі, що вказує на доцільність і перспективність використання цієї нової системи для оцінки реальної дії хімічних сполук.
3. Життєздатність клітин у ко-культурі знаходилась у прямій залежності від того, клітини якого органного походження здатні прийняти на себе максимальне навантаження. За масивної загибелі клітин печінки (лінія клітин HepG2), яка виконує головну роль в детоксикації організму, у системі ко-культур цю функцію приймають на себе переважно кератиноцити. В умовах високої стійкості клітин шкіри і легенів значно відновлюється життєздатність гепатоцитів і нервових клітин. Так, в моделі, де кількість живих клітин печінки становила понад 50%, стабільність системи в цілому зростала, оскільки функція детоксикації перерозподілялась між клітинами печінки, легенів, шкіри (які, як відомо, теж беруть участь у процесах детоксикації).
ЛІТЕРАТУРА
1. Проблема нормы в токсикологии/ [И.М. Трахтенберг, Р.Е. Сова, В.О. Шефтель, Ф.А. Оникиенко]// — Москва "Медицина" 1991 — 203 с.
2. Резников А.Г. Проблемы этики при проведении экспериментальных медицинских и биологических исследований на животных в Украине/ А.Г. Резников [под ред. Ю.И. Кундиева]//Антология биоэтики. — Львов: БаК, 2003 — С. 395-399.
3. Guidance Document on Using in Vitro Data to Estimate in Vivo Starting Doses for Acute Toxicity. / National Institute of Environmental Health Sciences. National Institutes of Health U.S. Public Health Service, Department of Health and Human Services// — 2001 — P. 1-21.
4. Альтернативні методи і тест-системи. / [І.М. Трахтенберг, В.М. Коваленко, Н.В. Кокшарева и др. / — Київ ВД "Авіцена", 2008 — 268 с.
5. Jared W. Allen. In Vitro Zonation and Toxicity in a Perfused Hepatocyte Co-Culture / Jared W. Allen, Salman R. Khetani, and Sangeeta N. Bhatia.// Toxicological Sciences — 2004 — Vol.84, №1 — P. 110-119
6. Bas J. Blaauboer. The Integrated Use of Alternative Methods in Toxicological Risk Evaluation / Bas J. Blaauboer, Martin D. Barratt, J.Brian Houston// ECVAM Integrated Nesting Strategies Task Force report — ATLA, 2009 —№ 27 — P. 229-237.
7. Переваги методу дослідження токсичного впливу сполук важких металів в культурі клітин людини in vitro порівняно з традиційним методом in vivo на тваринах як більш достовірного та адекватного / [І.М. Трахтенберг, М.Л. Марченко, Н.О. Бездєнєжних, Ю.Й. Кудрявець] / Сучасні проблеми токсикології — Київ, ООО "ИИО "Медицина Украины", 2010 — № 2-3 — C. 69-72.
8. Li A.P. A novel in vitro system, the integrated discrete multiple organ cell culture (IdMOC) system, for the evaluation of human drug toxicity: comparative cytotoxicity of tamoxifen towards normal human cells from five major organs and MCF-7 adenocarcinoma breast cancer cells. / Li, A.P., Bode, C. & Sakai, Y. // Chem. Biol. Interact. — 2004 — 150(1) — 129 p. — P. 36-42.
9. Plumb JA. Cell sensitivity assays: the MTT assay / J.A. Plumb / Methods Mol. Med. — 2004 — V. 88 -165 p. — P. 9.
10. Cadmium induces intracellular Ca2+-and H2O2-dependent apoptosis through JNK- and p53-mediated pathways in skin epidermal cell line / YO Son, JC Lee, JA Hitron. [et al.]// Toxicol. Sci. 2010 — Vol. 113, №1 — P.127-137.
REFERENCES
1. Problema normy v toksikologii/ [I.M. Trakhtenberg, R.E. Sova, V.O. Sheftel', F.A. Onikienko]// — Moskva "Medicina" 1991 — 203 s.
2. Reznikov A.G. Problemy etiki pri provedenii eksperimental'nykh medicinskikh i biologicheskikh issledovanij na zhivotnykh v Ukraine/ A.G. Reznikov [pod red. Yu.I. Kundieva]//Antologiya bioetiki. — L'vov: BaK, 2003 — S. 395-399.
3. Guidance Document on Using in Vitro Data to Estimate in Vivo Starting Doses for Acute Toxicity. / National Institute of Environmental Health Sciences. National Institutes of Health U.S. Public Health Service, Department of Health and Human Services// — 2001 — P. 1-21.
4. Al'ternatyvni metody i test-systemy. / [I.M. Trakhtenberh, V.M. Kovalenko, N.V. Kokshareva y dr. / — Kyiv VD "Avicena", 2008 — 268 s.
5. Jared W. Allen. In Vitro Zonation and Toxicity in a Perfused Hepatocyte Co-Culture / Jared W. Allen, Salman R. Khetani, and Sangeeta N. Bhatia.// Toxicological Sciences — 2004 — Vol.84, №1 — P. 110-119
6. Bas J. Blaauboer. The Integrated Use of Alternative Methods in Toxicological Risk Evaluation / Bas J. Blaauboer, Martin D. Barratt, J.Brian Houston// ECVAM Integrated Nesting Strategies Task Force report — ATLA, 2009 —№ 27 — P. 229-237.
7. Perevahy metodu doslidzhennya toksychnoho vplyvu spoluk vazhkykh metaliv v kul'turi klityn lyudyny in vitro porivnyano z tradycijnym metodom in vivo na tvarynakh yak bil'sh dostovirnoho ta adekvatnoho / [I.M. Trakhtenberh, M.L. Marchenko, N.O. Bezdenezhnykh, Yu.J. Kudryavec'] / Suchasni problemy toksykolohii — Kyiv, OOO "IIO "Medycyna Ukrayny", 2010 — № 2-3 — C. 69-72.
8. Li A.P. A novel in vitro system, the integrated discrete multiple organ cell culture (IdMOC) system, for the evaluation of human drug toxicity: comparative cytotoxicity of tamoxifen towards normal human cells from five major organs and MCF-7 adenocarcinoma breast cancer cells. / Li, A.P., Bode, C. & Sakai, Y. // Chem. Biol. Interact. — 2004 — 150(1) — 129 p. — P. 36-42.
9. Plumb JA. Cell sensitivity assays: the MTT assay / J.A. Plumb / Methods Mol. Med. — 2004 — V. 88 -165 p. — P. 9.
10. Cadmium induces intracellular Ca2+-and H2O2-dependent apoptosis through JNK- and p53-mediated pathways in skin epidermal cell line / YO Son, JC Lee, JA Hitron. [et al.]// Toxicol. Sci. 2010 — Vol. 113, №1 — P.127-137.
Надійшла до редакції 23.02.2011