Лікування хворих на злоякісні новоутворення та пошук ефективних малотоксичних протипухлинних лікарських засобів — це одна з найважливіших проблем сучасної медицини та інших хіміко-біологічних наук, зокрема фармацевтичної хімії.
Знання особливостей ракової клітини, її метаболізму дозволяє прогнозувати напрямок хімічних і біологічних досліджень, проводити цілеспрямований синтез потенціальних ліків, оцінювати можливість їх застосування в онкологічній практиці в якості протипухлинних засобів.
Один з найуспішніших напрямків пошуку нових протипухлинних засобів стосується антиметаболітів піримідинового та пуринового обміну. Вони беруть участь як переформовані сполуки в біосинтетичних процесах (ДНК, РНК, специфічні білки), гальмуючи пухлинний ріст [1-4].
В арсеналі протипухлинних засобів значне місце посідають ліки, що відносяться до гетероциклічних систем (рак кишково-шлункового тракту та ін. [4-6].
Означена проблема пошуку нових протипухлинних засобів серед пуринових і піримідинових систем є вкрай актуальною. Але аналіз літературних наукових джерел показав: нині бракує сучасної інформації щодо даної проблеми у світлі останніх досягнень різних галузей науки.
Молекули 5(6)-фторо(галогено)заміщених урацилів та їх похідних здатні виконувати роль галогеновмісних синтонів в органічному синтезі, тому їх активно використовують для створення оригінальних біологічно активних молекул. Крім того, введення вказаних фармакофорів до гетероциклічної молекули призводить до підвищення розчинності сполук у ліпідах та робить лікарські засоби ефективнішими завдяки здатності легкого їхнього транспортування в організмі [7]. При цьому зазначена увага до фторо(галогено)вмісних фрагментів у нових молекулах передбачає підсилення антиметаболітних властивостей сполук.
Мета даної роботи полягає в хімічній модифікації молекули 5-бромоурацилу з подальшим вивченням біологічної активності нових синтезованих похідних 5-бромоурацилу. Після конструювання потенційно активних структур розроблено нові препаративні методи синтезу оригінальних гетероциклів на основі 5-бромоурацилу, а також фторовмісних синтонів — загального анестетика фторотану (2-бром-1,1,1-трифтор-2-хлоретану) або 1,1-діетилкарбокси-2-хлор-2-трифторметилетилену; досліджено токсичність та протипухлинну активність одержаних сполук.
Матеріали та методи дослідження
Об'єктами дослідження стали: нові гетероциклічні моно- та біс-похідні, які синтезовано на основі 5-бромоурацилу та фторотану або 1,1-діетилкарбокси-2-хлор-2-трифторметиле-тилену в якості фторовмісних синтонів. Абсолютні розчинники одержували перегонкою над P2O5 або металевим натрієм, перегонкою у вакуумі або простою перегонкою; сушили над сульфатом магнію безводним. Індивідуальність синтезованих сполук контролювали методом ТШХ на пластинах Silufol-254 в системі ацетонітрил-гексан 2:1. ГРХ виконували на газорідинному хроматографі "Perkin Elmer" з УФ-детектором (виробник "Perkin", Germany). ІЧ спектри записували на спектрофотометрі UR-20 (виробник "Charles Ceise Hena", Germany). Спектри 1Н ЯМР записували на приладах "Bruker WP-200" (виробник "Bruker", Switzerland), "Varian T-60" (виробник "Varian", USA) з робочою частотою 200-132 МГц в DMSO-d6 з використанням тетраметилсилану як внутрішнього стандарту.
N(1)-(1,1 '-дифлуоро-2'-бромо-2 -хлороетил)-5-бромоурацил (1), ІЇ(1)-(2'-бромо-Г-гідрокси-2'-хлороетеніл)-5-бромоурацил (2). Приготування розчину № 1 проводили на основі 0.44 г (0.0079 моль) калій гідроксиду, 0.044 г ДБ-18-краун-6 в 20 мл сухого бензену та розчину 1.57г (0.84 мл, 0.0079 моль) фторотану в 20 мл сухого етеру. Приготування розчину № 2. 1.51г (0.0079 моль) 5-бромоурацилу розчиняють в 40 мл сухого ДМФА при температурі 60оС в окремому хімічному посуді. Гарячий розчин № 2 додають краплями через ділильну лійку до розчину № 1, перемішують при температурі 60-80оС 7 годин (реакційна суміш мутніла та при нагріванні ставала коричневою), фільтрують у гарячому стані, охолоджують, відганяють простою перегонкою розчинники. Залишок — осад промивають 30 мл суміші діетиловий етер-гексан (1:1), сушать у вакуумі водострумного насосу. Кристалічний осад кремового забарвлення (1). Т пл. 282-285оС, вихід 42% (1.22г). Знайдено, %: С 19.44; Н 0.80; N 7.53. C6H3Br2ClF2N2O2. Обчислено, %: С 19.56; Н 0.82; N 7.60. Охолоджений фільтрат залишають на ніч, відганяють розчинники. Залишок — масло кристалізують із суміші діетиловий етер-гексан (1:1). Осад, що випадав, сушать на повітрі (2). Т пл. 274-277оС, вихід 10,5% (0.28г). Знайдено, %: С 20.33; Н 0.89; N 7.88. C6H3Br2ClN2O3. Обчислено, %: С 20.80; Н 0.87; N 8.08.
Аналогічно синтезують сполуку N(1),N(1 )-(2"-бромо-2"-хлороетеніл)-біс-(5-бро-моурацил) (3) із 0.87г (0.0044 моль) фторотану та 1.67г (0,0088 моль) 5-бромоурацилу при перемішуванні реакційної суміші при температурі 80-90оС 12 годин. Синтезовану сполуку — кристалічний порошок кремового забарвлення промивають 30 мл метилового спирту, 10 мл етилового етеру, сушать у вакуумі водострумного насосу. Т пл. з осмоленням 270—275оС, вихід 30% (3.69г). Знайдено, %: С 22.8; Н 1.02; N 10.75; Br 45.96. C10H4Br3ClN4O4. Обчислено, %: С 23.13; Н 0.77; N 10.78; Br 46.1. 1,1-діетилкар б окси - 2-трифлуорометил-2-хлороетилен (4). 1,1 -діетилкар бокси- 2-трифлуорометил-2-(5'-бромоуридин-К(Г)-)-етилен (5).
Приготування розчину № 1 (І Стадія реакції). 6.13г (0.268 моль) натрію металічного розчиняють в 250 мл метанолу безводного, додають краплями через ділильну лійку 43.0г (40 мл, 0.268 моль) діетилового естеру малонової кислоти та 62.0г (40 мл, 0.543 моль) трифлуо-роцтової кислоти при перемішуванні реакційної суміші та нагріванні. Кип'ятять суміш протягом 6 год, охолоджують до кімнатної температури, відганяють простою перегонкою розчинник. Залишок — скловидну масу білого кольору заливають діетиловим етером. Осад білого кольору (продукт А), що випадає відфільтровують та використовують на наступній стадії реакції.
Приготування розчину № 2 (ІІ Стадія реакції). 8.0г (0.0287 моль) продукту А розчиняють в 55 мл сухого дихлоретану при кімнатній температурі, додають 6г (0.0287 моль) фосфору пентахлориду. Реакційна суміш при нагріванні набуває молочного забарвлення. Гарячий розчин перемішують з кип'ятінням 5 годин, охолоджують, осад, що утворився, відфільтровують, промивають дихлоретаном, відганяють розчинник. Залишок — масло очищують перегонкою у вакуумі, Масло (продукт В) розчинне у ДМФА, діетиловому етері. Т кип. 56-59оС (25 мм рт. ст.), n25D 1.3010, вихід 80% (6.31 г) (4). Знайдено, %: С 39.36; Н 3.67; F 20.75. C9H10ClF3O4. Обчислено, %: С 39.37; Н 3.64; F 20.76.
Приготування роз чину № 3 (ІІІ Стадія реакції). До суміші 0.34г (0.001 моль) 5-бромоурацилу в 30 мл ДМФА безводного та 0.18г (0.24 мл, 0.001 моль) триетиламіну безводного додають по краплях 0.5г (0.001 моль) продукту В у 15 мл етеру діетилового безводного при перемішуванні реакційної суміші та нагріванні до 60-70оС. Кип'ятять суміш протягом 16 год (реакційна суміш яскраво-червоного забарвлення), фільтрують гарячий розчин та відділяють осад N(C2H5)3xHCl, відганяють розчинники у вакуумі. Залишок — масло жовтого забарвлення заливають гексаном та кип'ятять, зливають гексан декантацією, заливають ацетон. Осад рожевого забарвлення випадав із ацетону. Т пл. 255-260оС, вихід 33% (0.25г) (5). Знайдено, %: С 37.03; Н 2.40; N 6.48; Br 19.0. C13H12BrF3N2O6. Обчислено, %: С 36.4; Н 2.8; N 6.50; Br 18.64.
Під час проведення хіміко-біологічних досліджень нами були відібрані серед значної кількості синтезованих преформованих піримідинів та досліджено сполуки із значущою протипухлинною дією [8]. Слід зазначити, що в молекулах більшості з цих сполук гетероциклічні фрагменти пов'язані залишком молекули загального анестетика фторотану, який широко використовується в хірургічній онкологічній практиці [9, 10].
Дослідження параметрів гострої токсичності та протипухлинної активності моно- і біс-похідних 5-бромоурацилу виконано в Інституті фармакології та токсикології АМН України. Вивчення гострої токсичності (ЛД50) проведено на білих нелінійних мишах-самцях з масою тіла 17,0±2,0г при підшкірному шляху введення. Результати досліду обраховано в альтернативній формі на 14 добу після введення. Статистична обробка проведена за [11]. Оскільки структурних аналогів синтезованих сполук у літературі не описано, препаратом порівняння був відомий протипухлинний лікарський засіб 5-фторурацил. Доза речовини становила від 600 до 250 мг/кг. У піддослідних тварин спостерігалися тонічні судоми впродовж 1-2 годин, блювання.
Протипухлинну активність нових сполук: N(1)-(1',1'-дифлуоро-2'-бромо-2'-хлороетил)-5-бромоурацил (1), N(1)-(2'-бромо-1'-гідрокси-2'-хлороетеніл)-5-бромоурацил (2), N(1),N(1)-(2"-бромо-2"-хлороетеніл)-біс-(5-бромоурацил) (3), 1,1-діетилкарбокси-2-трифлуорометил-2-(5'-бромоуридин-N(1'))-)-етилен (5) досліджено з використанням операційного та біопсійного матеріалу з пухлини мозку людини. При лікуванні гліобластоми людини в підкапсульному тесті за методом Богдена критерієм значення був відсоток гальмування росту гетеротрансплантату гліоми людини понад 25% [9, 11]. Курс лікувальних вливань становив 6 введень через добу при внутрішньоочеревинному шляху введення, згідно із правилами введення речовин до організму піддослідних тварин в інтервалі доз 1/4-1/5 ЛД50. Результати обраховано через 24 години після закінчення лікування. Для вивчення специфічної протипухлинної активності досліджуваних сполук, їх розчиняли у фізіологічному розчині.
Результати дослідження та їх обговорення
За новими, розробленими нами методами синтезу, взаємодією фторотану в якості фторовмісного синтону з 5-бромоурацилом у молярному співвідношенні 1:2 та 1:1 в системі розчинників (бензен-ДМФА-діетиловий етер) в умовах міжфазного каталізу ДБ-18-кра-ун-6-ефіром (лужне середовище); іншого фторовмісного синтону 1,1-діетилкарбокси-2-хлор-2-трифторметилетилену в еквімолярних кількостях у системі розчинників (діетиловий етер-ДМФА-гексан-ацетон) синтезовано нові моно- та біс-похідні з фармакофорними групами =C=CBrCl, -CF2-CHBrCl, -(HO)C=CBrCl, -(CF2)C=C(СООC2Н5)2 (1-5) (рисунки 1-3).
Дослідження гострої токсичності синтезованих сполук (1-5) (табл. 1) показало, що монопохідні 5-бромоурацилу (1, 2) та біс-похідне 5-бромоурацилу (3) менш токсичні (у 1,05-1,11 рази), ніж 5-фторурацил (ЛД50 становить 375 мг/кг). Значення їх ЛД50 знаходяться в межах від 415 мг/кг до 396 мг/кг.
Рис.1. Схема синтезу моно-похідних 5-бромоурацилу (1, 2)
Рис. 2. Схема синтезу біс-похідного 5-бромоурацилу (3)
Рис. 3. Схема синтезу моно-похідного 1,1-діетилкарбокси-2-хлор-2-трифторметилетилену (4) та 5-бромоурацилу (5)
Таблиця 1
Параметри токсичності сполук (1-3) у порівнянні з 5-фторурацилом
Виявлено, що протипухлинна активність біс-похідного 5-бромоурацилу (3) значно перевищує прийнятий критерій значущості (>25,0% гальмування пухлинного росту). Після лікування тварин сполукою (3) маса гетеротрансплантатів злоякісної гліоми зменшувалася з 2,68+0,102 мг до 1,51+0,102 мг, що становить 43,8% гальмування росту пухлини. Це у 1,75 раза більше прийнятого критерію активності при лікуванні гліобластоми 25%, що підтверджено при проведенні морфологічного контролю.
При порівняльному гістологічному дослідженні клітинно-тканинних реакцій пухлини при лікуванні потенційною протипухлинною сполукою (3) в умовах субклітинного тестування встановлено залежність між вираженими регресивними змінами пухлин та рівнем гальмування їх росту. Зазначений ефект вважається вираженим щодо подальшого вивчення біс-похідного (3) при пухлинах головного мозку.
Таким чином, можна зробити висновок, що біс-похідне (3) має високу протипухлинну активність на злоякісній гліобластомі людини, значно перевищує протипухлинну активність препарату порівняння 5-фторурацилу, що дозволяє розглядати її як фізіологічно активну з перспективою подальшого вивчення за критеріями сучасних вимог до потенційних протипухлинних засобів для лікування людини.
Висновки
1. За новими, розробленими нами методами синтезу, взаємодією фторотану або 1,1-діетилкар-бокси-2-хлор-2-трифторметилетилену з 5-бро-моурацилом в молярному співвідношенні 1:2 або еквімолярних кількостях в умовах міжфазного каталізу ДБ-18-краун-6-ефіром синтезовано нові моно- та біс-похідні 5-бромоурацилу.
2. Дослідження гострої токсичності синтезованих сполук показало, що вони малотоксичні: значення їх ЛД50 коливаються в межах від 415 мг/кг до 396 мг/кг.
3. При використанні пухлини головного мозку людини (операційний та біопсійний матеріал) в підкапсульному тесті за методом Богдена, на підставі результатів експериментально-морфологічних досліджень зареєстровано виражений протипухлинний ефект біс-похідного 5-бромоурацилу з відсотком гальмування пухлинного росту 43,8% (критерій значущості > 25%).
ЛІТЕРАТУРА
1. Noordhuis P. 5—fluorouracil incorporation info RNA and DNA in relation to thymidilate synthetase inhibition human colorectal cancer / P. Noordhuis, U. Holwerda // Annals. of oncol. — 2004. — Vol. 15. — P. 1025—1032.
2. Adjei A. A review of pharmacology and clinical activity of new chemotherapy agents for the treatment of colorectal cancer / A. Adjei // Clin. Pharmacol. — 1999. — Vol. 48. — P. 265—277.
3. Longley D.B. Mechanisms of action of 5—fluorouracil / D.B. Longley, D.P. Harkin // Nature Rev. Cancer. — 2004. —Vol. 4. — P. 230—238.
4. Барлоу Р. Введение в химическую фармакологию/ Р. Барлоу . — М.: Изд. ин. лит., 1959. — С. 107.
5. Brody G.L. Halothane anesthesia as a possible cause of massive hepatic necrosis / G.L. Brody, R.B. Sweet // Anesthesiology. — 1963. — Vol. 24. — P. 29—37.
6. Brown B.R. Biotransformation and hepatotoxicity ofhalothane / B.R. Brown, I.G. Sipes // Biochem. Pharmacol. — 1977. —Vol. 26. — P. 2091—2094.
7. Ягупольский Л.М. Ароматические и гетероциклические соединения с фторсодержащими заместителями / Л.М. Ягупольский. — Киев: Наукова думка, — 1988. — С. 90—105.
8. Welchinska Hel.V. Biological activity of bacterial lectins and their molecular complexes with heterocyclic bis—adducts / Hel.V. Welchinska, B. Piecuszak, E.A. Kovalenko, N.I. Sharykina [et al.] // Мікробіол. журн. — 2003. — Т.65, №6. — C. 20—25.
9. Прозоровский В.Б. Экспресс метод определения средней эффективности дозы и ее ошибки / В.Б. Прозоровский, В.П. Прозоровский , В.М. Демченко. // Фармакол. и токсикол. — 1978. — Т. 41, № 4. — С. 407—509.
10. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США / [под ред. З.П. Софьиной, А.Б. Сыркина, А. Голдина, А. Кляйна]. — М.: Медицина, 1979. — 296 с.
11. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний / [Под ред. Н.И. Переводчиковой, 2—ое изд. доп.].— М.: Практическая медицина, 2005. — 704 с.
REFERENCES
1. Noordhuis P. 5—fluorouracil incorporation info RNA and DNA in relation to thymidilate synthetase inhibition human colorectal cancer / P. Noordhuis, U. Holwerda // Annals. of oncol. — 2004. — Vol. 15. — P. 1025—1032.
2. Adjei A. A review of pharmacology and clinical activity of new chemotherapy agents for the treatment of colorectal cancer / A. Adjei // Clin. Pharmacol. — 1999. — Vol. 48. — P. 265—277.
3. Longley D.B. Mechanisms of action of 5—fluorouracil / D.B. Longley, D.P. Harkin // Nature Rev. Cancer. — 2004. —Vol. 4. — P. 230—238.
4. Barlou R. Vvedenie v khimicheskuyu farmakologiyu/ R. Barlou . — M.: Izd. in. lit., 1959. — S. 107.
5. Brody G.L. Halothane anesthesia as a possible cause of massive hepatic necrosis / G.L. Brody, R.B. Sweet // Anesthesiology. — 1963. — Vol. 24. — P. 29—37.
6. Brown B.R. Biotransformation and hepatotoxicity ofhalothane / B.R. Brown, I.G. Sipes // Biochem. Pharmacol. — 1977. —Vol. 26. — P. 2091—2094.
7. Yagupol'skij L.M. Aromaticheskie i geterociklicheskie soedineniya s ftorsoderzhaschimi zamestitelyami / L.M. Yagupol'skij. — Kiev: Naukova dumka, — 1988. — S. 90—105.
8. Welchinska Hel.V. Biological activity of bacterial lectins and their molecular complexes with heterocyclic bis—adducts / Hel.V. Welchinska, B. Piecuszak, E.A. Kovalenko, N.I. Sharykina [et al.] // Мікробіол. журн. — 2003. — Т.65, №6. — C. 20—25.
9. Prozorovskij V.B. Ekspress metod opredeleniya srednej effektivnosti dozy i ee oshibki / V.B. Prozorovskij, V.P. Prozorovskij , V.M. Demchenko. // Farmakol. i toksikol. — 1978. — T. 41, № 4. — S. 407—509.
10. Eksperimental'naya ocenka protivoopukholevykh preparatov v SSSR i SShA / [pod red. Z.P. Sof'inoj, A.B. Syrkina, A. Goldina, A. Klyajna]. — M.: Medicina, 1979. — 296 s.
11. Rukovodstvo po khimioterapii opukholevykh zabolevanij / [Pod red. N.I. Perevodchikovoj, 2—oe izd. dop.].— M.: Prakticheskaya medicina, 2005. — 704 s.
Надійшла до редакції 1.02.2013 р.