Актуальність пошуку ефективних і малотоксичних протипухлинних препаратів безперечна. Не менш важливим є дослідження найбільш ранніх етапів малігнізації задля максимально успішної протипухлинної терапії [1-3].
Відомо, що будь-яке порушення нормальної життєдіяльності клітини призводить до порушення рівноваги між процесами окиснення і відновлення. Вільнорадикальне окиснення зумовлює пошкодження макромолекул, що може приводити до загибелі клітини або її злоякісного переродження, хоча перекиси ліпідів у низьких концентраціях стимулюють проліферацію клітин [4-6]. Високий рівень активних форм кисню та продуктів окисної модифікації ДНК є характерним для запальних захворювань кишечнику, деякі хронічні форми яких вважаються передраковим станом. Про-тективна роль антиоксидантів і значення ферментів антиоксидантного захисту при цих захворюваннях є доведеними [7,8]. Крім того, відомим є антиканцерогенний ефект нестероїдних протизапальних засобів, що використовуються для лікування зокрема виразкового коліту, серед механізмів дії яких — блок оксидативного стресу в тому числі [9].
Тому метою даної роботи було дослідження впливу цитостатичної сполуки похідного дигідропіролу (Д1, 5-аміно-4-(1,3-бензотіазол-2-іл)-1-(3-метоксифеніл)-1,2-дигідро-3Н-пірол-3-он) на слизову оболонку кишечнику щурів як швидко проліферуючу тканину за умов оксидативного стресу. Д1 було синтезовано Хіміко-біологічним центром Київського національного університету імені Тараса Шевченка як структурний аналог таргетних інгібіторів протеїн-кіназ, була показана його висока антипроліферативна активність на пухлинних клітинних лініях [10,11] та протипухлинна активність за умов хімічно-індукованого канцерогенезу [12].
Матеріали і методи дослідження. Дослідження впливу Д1 на слизову оболонку кишечнику щурів на тлі оксидативного стресу проводили на білих безпородних щурах-самцях з масою тіла 270 г, які утримувались у стандартних умовах віварію. Д1 вводили per os у дозі 2,3 мг/кг маси тіла (що за умов повного всмоктування створює концентрацію його в крові 10-4М [10]) розчиненим у соняшниковій олії, що містить 15% ДМСО (всього 0,1 мл). Оксидативний стрес викликали хлоридом кобальту (ІІ) [5], що вводився внутрішньоочеревинно у дозі 13 мг/кг маси тіла (1/3 LD50) в 0,1 мл фізіологічного розчину. Контрольним тваринам вводили відповідні розчинники у таких же об'ємах. Схема експерименту наведена у табл. 1.
Досліджувані речовини вводили щоденно натще протягом 10 днів. Через 1 добу після останнього введення тварин забивали під ефірним наркозом, органи для дослідження вилучали негайно.
Таблиця 1
Схема експерименту
Для гістологічного аналізу використовували фрагменти порожньої, ободової, прямої кишки, фіксовані у 10% нейтральному сольовому формаліні. Виготовлення постійних препаратів для світлової мікроскопії та їх забарвлення гематоксилін-еозин-оранжем здійснювали за стандартною методикою [13]. Препарати аналізували на мікроскопі Olympus BX41 (Olympus Europe GmbH, Японія) з використанням камери Olympus C-5050 Zoom (Olympus Europe GmbH, Японія) і програмного забезпечення Olympus DP-Soft 3.2 для фотознімків, морфометричні дослідження здійснювали за допомогою програми WCIF Image J (роздільна здатність 1600x1200 пікселів). Оцінювали архітектоніку та стан судинного русла слизової оболонки на поперечному зрізі, також вимірювали у препаратах порожньої кишки: товщину слизової оболонки, довжину, товщину ворсинок, глибину крипт, параметри епітеліальної вистилки ворсинок (висоту ентероцитів та площу перетину їх ядер, площу перетину келихоподібних клітин та їх відносну кількість на латеральній поверхні ворсинки), мітотичний індекс у криптах; у препаратах ободової та прямої кишки: товщину слизової оболонки, глибину та ширину крипт, параметри епітеліальної вистилки, мітотичний індекс. Статистичну обробку даних здійснювали за допомогою програми SPSS 10.0:, підраховували середнє значення і похибку середнього для кожного параметру, статистичну значимість визначали за допомогою U-тесту Манна-Уїтні. Відмінності вважали вірогідними при р<0,05.
Таблиця 2
Значення морфометричних показників слизової оболонки кишечнику тварин групи контролю
Результати та їх обговорення. У тварин контрольної групи слизова оболонка кишечнику (табл. 2) має типову гістологічну структуру без ознак патологічних процесів [14, 15].
У групі Д1 ворсинки слизової оболонки порожньої кишки (тонкий кишечник) іноді розширені, з дещо збільшеним кровонаповненням та інфільтрацією строми, незначні осередки запалення спостерігаються рідко [15]. Подекуди має місце десквамація епітелію. Порівняно з контролем у слизовій оболонці порожньої кишки вірогідно зростають: глибина крипт (на 7,6%), товщина ворсинок (на 12,3%), площа перетину ядер ентероцитів (на 5,6%), відносна кількість келихоподібних клітин (на 20,1%) та площа їх перетину (на 10,3%) (рис. 1).
Рис. 1. Стан слизової оболонки порожньої кишки щурів при дії Д1 у нормі та за умов Со-індукованого оксидативного стресу (*р<0,05).
В обох відділах товстого кишечнику має місце деяка лімфо-інфільтрація власної пластинки, невеликі скупчення лімфоцитів у верхній частині слизової оболонки, крім того, поодинокі лімфостази у прямій кишці. Загалом же стан слизової оболонки товстого кишечнику наближається до контролю. У слизовій оболонці ободової кишки, на відміну від порожньої, вірогідно зменшуються глибина крипт (на 6,9%), висота ентероцитів (на 8,2%), площа перетину їх ядер (на 6,9%), площа перетину келихоподібних клітин (на 10,5%) та їхня відносна кількість (на 11,7%) (рис. 2). У прямій кишці вірогідно зменшуються ширина крипт (на 7,2%) і площа ядер ентероцитів (на 21,3%) (рис. 3).
Отже, Д1 по-різному впливає на різні відділи кишечнику щурів. У тонкому кишечнику Д1 певним чином впливає на кровоносне русло власної пластинки слизової оболонки (збільшення кровонаповнення, деякий набряк строми ворсинок). У товстому кишечнику більш чутливими виявляються лімфатичні капіляри — наявність деякої лімфо-інфільтрації в обох відділах, лімфостази в прямій кишці. Зміни морфометричних параметрів слизової оболонки тонкого кишечнику можуть свідчити [14,15] про розвиток компенсаторно-пристосувальних реакцій у вигляді активації оновлення епітелію і посилення слизоутворення як реакції на токсикант. У слизовій оболонці товстого кишечнику, навпаки, спостерігаються ознаки пригнічення слизоутворення і функціональної активності колоноцитів. Вірогідного зниження мітотичного індексу не спостерігається, тобто Д1 як цитостатична сполука не інгібує проліферацію нормальних клітин за короткотривалого впливу.
У тварин групи з Co-індукованим оксидативним стресом у слизовій оболонці порожньої кишки спостерігається набряк ворсинок, що супроводжується лімфо-інфільтрацією їх строми, частими невеликими розширеннями кровоносних капілярів. Часто зустрічаються осередки запалення. Зрідка зустрічається незначна десквамація епітелію [16]. Порівняно з контролем вірогідно зменшуються товщина слизової оболонки (на 14,0%), довжина ворсинок (на 10,1%), глибина крипт (на 9,7%), мітотичний індекс (на 28,1%) та вірогідно збільшуються товщина ворсинок (на 43,0%), висота ентероцитів (на 11,6%) та площа перетину їх ядер (на 10,2%) (рис. 1). У слизовій оболонці товстого кишечнику спостерігається значне збільшення лімфовузлів, лімфо-інфільтрація власної пластинки, осередки запалення, у прямій кишці — також розширення кровоносних і лімфатичних капілярів. У слизовій оболонці ободової кишки вірогідно зменшуються ширина крипт (на 8,4%), висота колоноцитів (на 9,4%), відносна кількість келихоподібних клітин (на 10,1%) та мітотичний індекс (на 25,7%) (рис. 2). У слизовій оболонці прямої кишки також вірогідно зменшуються ширина крипт (на 11,5%), висота епітеліоцитів (на 5,3%) і площа перетину їх ядер (на 40,2%), та, на відміну від попередніх відділів кишечника, зростають товщина слизової оболонки (на 6,2%) і глибина крипт (на 6,8%) (рис. 3).
Рис. 2. Стан слизової оболонки ободової кишки щурів при дії Д1 у нормі та за умов Со-індукованого оксидативного стресу (*р<0,05).
Рис. 3. Стан слизової оболонки прямої кишки щурів при дії Д1 у нормі та за умов Со-індукованого оксидативного стресу (*р<0,05).
Таким чином, при оксидативному стресі ушкоджується переважно судинне русло (розширення капілярів і набряки), потоншується слизова оболонка, іде запальний процес у всіх відділах слизової оболонки кишечнику. Вплив на епітеліальний шар є незначним. Спостерігається пригнічення проліферативної активності стовбурових клітин крипт, що може бути пояснено затримкою клітин у G1 фазі мітотичного циклу для репарації пошкоджень ДНК [6]. Морфологічні зміни ентероцитів можуть свідчити [15] про розвиток пристосувальної реакції слизової у вигляді посилення функціональної активності ентероцитів. У той же час морфологічних змін у секреторному апараті слизової оболонки не спостерігається. Кількісні та якісні зміни клітин у товстому кишечнику можуть свідчити про пригнічення оновлення клітинних популяцій слизової оболонки внаслідок пригнічення проліферації стовбурових клітин [14].
У щурів групи CoCl2+Д1 у слизовій оболонці порожньої кишки ворсинки здебільшого нормальні, з цілісним епітелієм. Подекуди спостерігаються невеликі зони запалення, лімфо-інфільтрація, злиття ворсинок, руйнування ворсинок і десквамація епітелію [16]. Порівняно з контролем вірогідно збільшуються глибини крипт (на 17,9%), товщина ворсинок (на 46,3%), висота ентероцитів (на 19,0%) і площа перетину їх ядер (на 21,2%), площа перетину келихоподібних клітин (на 7,7%) (рис. 1). Слизова оболонка товстого кишечнику наближається до контролю. Іноді зустрічається незначна лімфо-інфільтрація, деяке збільшення лімфовузлів, а також пооднокі розширення кровоносних і лімфатичних капілярів у прямій кишці. У слизовій оболонці ободової кишки має місце вірогідне у порівнянні з контролем збільшення товщини слизової оболонки (на 7,2%), а також зменшення відносної кількості келихоподібних клітин (на 10,6%) та зниження мітотичного індексу (на 32,4%) (рис. 2). У слизовій оболонці прямої кишки вірогідно збільшуються товщина слизової оболонки (на 6,2%) і глибина крипт (на 4,9%), вірогідно зменшуються ширина крипт (на 18,4%), висота колоноцитів (на 9,9%) і площа перетину їх ядер (на 27,6%), площа перетину келихоподібних клітин (на 9,7%) (рис. 3).
Отже, Д1 дещо зменшує пошкоджуючу дію оксидативного стресу на слизову оболонку тонкого кишечнику (стан судинного русла ворсинок, рівень запального процесу, товщина слизової оболонки і довжина ворсинок наближаються до показників контролю), хоча лімфо-інфільтрація і набряк ворсинок залишаються практично без змін (у порівнянні з групою CoCl2). Морфологічні зміни ентероцитів, збільшення глибини крипт, кількісні та якісні зміни секреторного апарату ворсинок свідчать про розвиток пристосувальних реакцій слизової оболонки, характерних як для групи Д1, так і для групи CoCl2. У товстому кишечнику ознаки запального процесу у слизовій оболонці, як то набряк, лімфо-інфільтрація, збільшення лімфовузлів, також значно послаблюються. Зміни морфометричних параметрів слизової оболонки ободової та прямої кишок подібні до таких у групі з Со-індукованим стресом, отже, Д1 не впливає на пригнічення проліферації клітин при оксидативному стресі відповідно на його наслідки.
Висновки. Д1 впливає в основному на епітелій ворсинок слизової оболонки кишечнику щурів, що проявляється в його десквамації в тонкому кишечнику, пригніченні функціональної активності у відділах товстого кишечнику. Д1 не викликає значних змін у судинному руслі слизової, не пригнічує нормальну проліферацію клітин у криптах. Також мають місце компенсаторно-пристосувальні реакції організму на дану сполуку у вигляді посилення слизоутворення у тонкому кишечнику.
CoCl2, індукуючи оксидативний стрес, впливає в основному на судинне русло слизової оболонки усіх відділів кишечнику, що проявляється у вигляді набряку власної пластинки слизової, запального поцесу, кровостазів, збільшення лімфовузлів у товстому кишечнику. Також CoCl2 пригнічує проліферацію стовбурових клітин крипт слизової оболонки усіх відділів кишечнику і спричиняє зниження її функціональної активності у товстому кишечнику як наслідок — пригнічення оновлення клітин епітеліального шару. Вплив CoCl2 на епітелій ворсинок є компенсованим у вигляді посилення функціональної активності ентероцитів.
Д1 при дії на слизову оболонку кишечнику на тлі оксидативного стресу дещо нівелює токсичний вплив останнього — знижується рівень запального процесу в усіх відділах, нормалізується кровонаповнення ворсинок, хоча набряк їх строми зберігається. Рівень проліферативної активності клітин крипт у тонкому кишечнику нормалізується, але залишається на низькому рівні у товстому кишечнику, наслідком чого може бути зниження функціональної активності слизової оболонки цього відділу. Компенсаторно-пристосувальні реакції організму при одночасній дії Д1 і CoCl2 у тонкому кишечнику подібні до таких при дії цих сполук окремо, тобто сумуються. У товстому кишечнику при одночасній дії Д1 і CoCl2 домінують ефекти, спричинені оксидативним стресом.
Отже, різні відділи кишечнику реагують подібним чином як на введення Д1, так і на оксидативний стрес. У той же час у тонкому кишечнику активно виражена компенсаторно-пристосувальна відповідь організму, тоді як у товстому кишечнику домінують пригнічуючі ефекти. Також варто відзначити більшу чутливість до пошкоджуючих агентів судинного русла взагалі і лімфатичних капілярів, зокрема слизової оболонки товстого кишечнику, особливо прямої кишки, порівняно з тонким кишечником.
Таким чином, Д1 за дії на слизову оболонку кишечнику щурів як на тканину, що характеризується високим рівнем проліферації, за умов оксидативного стресу зменшує його токсичний вплив у всіх відділах кишечнику та інтенсифікує компенсаторно-пристосувальну відповідь організму у тонкому кишечнику, тобто проявляє антиоксидантні властивості, отже, є перспективним потенційним протипухлинним агентом.
ЛІТЕРАТУРА
1. Dancey J. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment / J.Dancey, E.A. Sausville // Nature Rev.Drug Discovery. — 2003. — V.2, №4. — P.296-313.
2. Телетаева Г.М. Профилактика и лечение желудочно-кишечных осложнений лекарственной терапии (тошнота и рвота, мукозиты, диарея) / Г.М. Телетаева // Практическая онкология, 2009. — Т.10, №3. — С.158-167.
3. Олийниченко П.И.Справочник по полихимиотерапии опухолей / П.И. Олийниченко, З.П. Булкина, Т.И. Синиборода. — К: Здоровье, 2000. — 301 с.
4. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell faction / W. Droge // Physiol. Rev. — 2001. — V.82. — P. 47-95.
5. Калиман П.А. Цикл глюкоза-жирные кислоты при оксидативном стрессе у крыс, вызваном хлоридом кобальта / П.А. Калиман, С.М. Охрименко // Укр.біохім.журн. —2005. — Т.77, №2. — С.154-158.
6. Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами [И.В. Кондакова, Г.В. Какурина, Л.П. Смирнова, Е.В. Борунов]. // Сибирский онкологический журнал. — 2005. — Т.13, №1. — С.58-61.
7. Allgayer H. Oinical relevance of oxygen radicals in inflammatory bowel disease — facts and fashion / H. Allgayer // Klin Wocherschr. — 1991. — V. 69. — P.1001-1003.
8. Никитина Н.В. Язвенный колит и рак толстой кишки: формирование групп риска, скрининг и профілактика / Н.В. Никитина, Е.А. Белоусова // Гастроэнтерология. — 2004. — Т.13, № 90.
9. Никитина Н.В. Химиопрофилактика колоректального рака: молекулярные механизмы антиканцерогенного действия аминосалицилатов и нестероидных противовоспалительных препаратов / Н.В. Никитина, Е.А. Белоусова // Гастроэнтерология. — 2005. — Т.14, № 109.
10. Дубініна Г.Г. Сполука 1,4-заміщених 5-аміно-1,2-дигідропірол-3-онів, що має протиракову активність / Г.Г. Дубініна, Ю.М. Воловенко // Патент № 22204 UA від 25.04.2007.
11. Цитотоксичний вплив на пухлинні клітини in vitro агентів з протипухлинним та антиметастатичним ефектом / Л.В. Гарманчук, Н.В. Сенчило, В.В. Нікуліна [та ін.] // Фізика живого. — 2011. — 19, № 2. — С.51-53.
12. Кузнєцова Г.М. Протипухлинна дія цитостатичної сполуки похідного дигідропіролу при хемо-індукованому канцерогенезі товстої кишки щурів. / Г.М. Кузнєцова // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. — 2011. — Вип. 5 (107). — С. 66-74.
13. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. / Р. Лилли — М.: Мир, 1969. — 648 с.
14. Парфенов А.И. Энтерология. / А.И. Парфенов. — М.: Триада-Х, 2002. — 744 с.
15. Jankowski J.A. Maintenance of normal intestinal mucosa: function, structure, and adaptation. / J.A. Jankowski, R.A. Goodlad, N.A. Wright // Gut. — 1994. — 35, 1 Suppl. — P.S1-4.
16. Вплив цитостатичної сполуки похідного дигідропіролу на слизову оболонку тонкого кишечнику щурів за умов дії оксидативного стресу / Г.М. Кузнєцова, Г.В. Островська, Ю.М. Воловенко [та ін.] // Проблеми екол. та мед.генетики і клін.імунології.збірник наук.праць. — Київ-Луганськ 2010. — Т.100, №4. — С.270-279.
REFERENCES
1. Dancey J. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment / J.Dancey, E.A. Sausville // Nature Rev.Drug Discovery. — 2003. — V.2, №4. — P.296-313.
2. Teletaeva G.M. Profilaktika i lechenie zheludochno-kishechnykh oslozhnenij lekarstvennoj terapii (toshnota i rvota, mukozity, diareya) / G.M. Teletaeva // Prakticheskaya onkologiya, 2009. — T.10, №3. — S.158-167.
3. Olijnichenko P.I.Spravochnik po polikhimioterapii opukholej / P.I. Olijnichenko, Z.P. Bulkina, T.I. Siniboroda. — K: Zdorov'e, 2000. — 301 s.
4. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell faction / W. Droge // Physiol. Rev. — 2001. — V.82. — P. 47-95.
5. Kaliman P.A. Cikl glyukoza-zhirnye kisloty pri oksidativnom stresse u krys, vyzvanom khloridom kobal'ta / P.A. Kaliman, S.M. Okhrimenko // Ukr.bіokhіm.zhurn. —2005. — T.77, №2. — S.154-158.
6. Regulyaciya proliferacii i apoptoza opukholevykh kletok svobodnymi radikalami [I.V. Kondakova, G.V. Kakurina, L.P. Smirnova, E.V. Borunov]. // Sibirskij onkologicheskij zhurnal. — 2005. — T.13, №1. — S.58-61.
7. Allgayer H. Oinical relevance of oxygen radicals in inflammatory bowel disease — facts and fashion / H. Allgayer // Klin Wocherschr. — 1991. — V. 69. — P.1001-1003.
8. Nikitina N.V. Yazvennyj kolit i rak tolstoj kishki: formirovanie grupp riska, skrining i profіlaktika / N.V. Nikitina, E.A. Belousova // Gastroenterologiya. — 2004. — T.13, № 90.
9. Nikitina N.V. Khimioprofilaktika kolorektal'nogo raka: molekulyarnye mekhanizmy antikancerogennogo dejstviya aminosalicilatov i nesteroidnykh protivovospalitel'nykh preparatov / N.V. Nikitina, E.A. Belousova // Gastroenterologiya. — 2005. — T.14, № 109.
10. Dubinina G.G. Spoluka 1,4-zamischenykh 5-amino-1,2-dygidropirol-3-oniv, scho mae protyrakovu aktyvnist' / G.G. Dubinina, Yu.M. Volovenko // Patent № 22204 UA vid 25.04.2007.
11. Cytotoksychnyj vplyv na pukhlynni klityny in vitro agentiv z protypukhlynnym ta antymetastatychnym efektom / L.V. Garmanchuk, N.V. Senchylo, V.V. Nikulina [ta in.] // Fizyka zhyvogo. — 2011. — 19, № 2. — S.51-53.
12. Kuznecova G.M. Protypukhlynna diya cytostatychnoi spoluky pokhidnogo dygidropirolu pry khemo-indukovanomu kancerogenezi tovstoi kyshky schuriv. / G.M. Kuznecova // Problemy ekologichnoi ta medychnoi genetyky i klinichnoi imunologii. — 2011. — Vyp. 5 (107). — S. 66-74.
13. Lilli R. Patogistologicheskaya tekhnika i prakticheskaya gistokhimiya. / R. Lilli — M.: Mir, 1969. — 648 s.
14. Parfenov A.I. Enterologiya. / A.I. Parfenov. — M.: Triada-Kh, 2002. — 744 s.
15. Jankowski J.A. Maintenance of normal intestinal mucosa: function, structure, and adaptation. / J.A. Jankowski, R.A. Goodlad, N.A. Wright // Gut. — 1994. — 35, 1 Suppl. — P.S1-4.
16. Vplyv cytostatychnoi spoluky pokhidnogo dygidropirolu na slyzovu obolonku tonkogo kyshechnyku schuriv za umov dii oksydatyvnogo stresu / G.M. Kuznecova, G.V. Ostrovs'ka, Yu.M. Volovenko [ta in.] // Problemy ekol. ta med.genetyky i klin.imunologii.zbirnyk nauk.prac'. — Kyiv-Lugans'k 2010. — T.100, №4. — S.270-279.
Надійшла до редакції 5.11.2012 р.