Для розв'язання прикладних завдань і фундаментальних проблем медицини і біології сьогодні все ширше використовуються природні та синтетичні похідні кумарину. Серед них виявлено багато біологічно активних сполук, що мають протипухлинну, протизапальну, антиоксидантну, діуретичну, ліпазотропну активності [1, 2, 3]. Одним із похідних кумаринів є 7-гідроксикумарин (С9Н6О8), який проявляє антидіабетичну дію [4]. Він широко поширений в багатьох видах рослин та може утворюватись в організмі людини при метаболізмі кумарину [5]. Токсикологічні властивості 7-гідроксикумарину ще недостатньо вивчені.
Для оцінки токсикологічних властивостей та потенційної небезпечності біологічно активних речовин для людини важливе значення має вид, стать та вік експериментальних тварин. У залежності від статевої приналежності тварин дія ксенобіотиків по-різному може впливати на роботу центральної нервової системи, поведінкові реакції тварин [6], змінювати активність основних ферментів, що включені до метаболізму ендогенних субстратів і синтетичних речовин [7, 8], а також впливати на показники білкового, вуглеводного і ліпідного обмінів різних видів лабораторних тварин [9, 10].
Метою даної роботи є дослідження статевих відмінностей біохімічних показників сироватки крові, сечі та морфо-функціонального стану внутрішніх органів щурів при субхронічній дії 7-гідроксикумарину.
Матеріали та методи дослідження
Досліди проведено на самцях та самках білих щурів з початковою масою 100-120 г. Щурів утримували при світловому дні на стандартному харчовому раціоні. Експериментальні групи тварин (по 5 самців та самок в группі) формували методом випадкової виборки з урахуванням маси тіла як визначального показника. Досліджувану речовину (7-гідроксикумарин), розведену дистильованою водою, вводили інтрагастрально за допомогою зонда щоденно вранці до годування тварин у дозах 50, 200 та 500 мг/кг протягом трьох місяців. Контрольним тваринам у вище зазначений спосіб вводили дистильовану воду. Щоденно спостерігали за загальним станом тварин, споживанням корму та води. Масу тіла щурів визначали щотижня. Щомісячно збирали добову сечу тварин, відсаджуючи їх у камери для збору сечі, перед тим вводили інтрагастрально 5 мл дистильованої води. Також щомісячно у щурів брали кров для проведення біохімічного дослідження із стегнової вени під легким ефірним наркозом, після чого їх піддавали евтаназії методом цервікальної дислокації, проводили макроскопічний аналіз внутрішніх органів. Через три місяці введення 7-гідроксикумарину додатково проводили гістологічні дослідження внутрішніх органів: печінки, нирок, легенів, селезінки, серця, шлунка, кишечнику, сім'яників, яєчників та мозку. На четвертий місяць (після місячного відновного періоду) у групі тварин, що отримували досліджувану речовину у дозі 500 мг/кг та у контрольній групі, проводили ті ж самі дослідження, що і після трьох місяців впливу.
Біохімічні показники в сироватці крові, яку отримували методом центрифугування при 1500 g 10 хв., визначали активність лактатдегідрогенази (ЛДГ), лужної фосфатази (ЛФ), вміст глюкози, хлоридів, сечовини, тригліцеридів за допомогою наборів реактивів фірми PLIVA-Lachema (Чеська Республіка), активність аланін- (АлАт) та аспартат-(АсАт) амінотрансфераз — "Реагент" (Україна), креатиніну, холестерину. Кількість білка визначали за методом Лоурі [11]. Сечу фільтрували та визначали в ній рН, питому вагу, вміст білка, креатиніну, сечовини, глюкози, та хлоридів за допомогою зазначених наборів реактивів.
Для гістологічного аналізу зразки тканин фіксували у рідині Буена, після стандартної гістологічної обробки заливали у парафін, робили зрізи товщиною 5-7 мкм та забарвлювали їх гематоксиліном-еозином-оранжем. Морфофункціональний стан внутрішніх органів оцінювали за загальноприйнятими критеріями [12].
Статистична обробка результатів була проведена за t-критерієм Стьюдента. Для відповідних розрахунків використовували стандартний пакет програм статистичного аналізу Microsoft Excel. Достовірною вважалась різниця при значеннях р< 0,05.
Результати та їх обговорення
Дослідження токсикодинаміки 7-гідроксикумарину за умов субхронічного (впродовж трьох місяців) внутрішньошлункового введення щурам (самцям і самкам) у дозах 50, 200 і 500 мг/кг показало, що 7-гідроксикумарин не викликав зміни таких показників крові: концентрація білка, холестерину, креатиніну, хлоридів, активність ферментів АсАт і ЛДГ упродовж трьох місяців експерименту.
Як видно з таблиці 1, за дії 7-гідроксикумарину в мінімальній дозі (50 мг/кг) у щурів самців спостерігалося зниження вмісту глюкози в крові на 58,2 % і підвищення концентрації кальцію на 40,3 % через 1 місяць. У самок підвищувалась концентрація тригліцеридів через 2 і 3 місяці впливу речовини (на 21,1 % і 43,1 %, відповідно) і активність АлАт (на 36,1 %) на 3 місяці дослідження.
Таблиця 1
Зміни біохімічних показників сироватки крові щурів під впливом 7-гідроксикумарину
7-гідроксикумарин у дозі 200 мг/кг викликав у щурів через 1 місяць зниження концентрації глюкози на 64,0 % у самців та на 50,3 % у самок. У самок дозозалежно підвищувався вміст тригліцеридів у всі терміни дослідження (на 140 %, 32,0 % і 69,6 % через 1, 2 і 3 місяці впливу речовини відповідно), підвищувався вміст сечовини на 31,3 % через 2 місяці та активність ферментів (АлАт — на 40,7 % і ЛФ — на 22,3 %) через 3 місяці дослідження. Концентрація кальцію в крові збільшувалась у самців — на 67,5 % на початку дослідження (1 міс.), у самок — на 95,3 % і 17,7 % через 1 та 2 місяці відповідно.
7-гідроксикумарин у дозі 500 мг/кг у самців викликав зниження концентрації глюкози у сироватці крові на 34,4 % на початку дослідження (1 міс.), концентрація сечовини у самців була підвищеною на 51,0 % на третьому місяці дослідження, зростала також активність ферментів — АлАт (на 54,0 % і 59,7 % через 2 і 3 міс. відповідно) та ЛФ (на 54,9 % через 3 міс.). У самок під впливом максимальної дози 7-гідроксикумарину знижувався вміст глюкози в сироватці крові — на 52,7 %, 40,0 % і 40,3 % та підвищувались концентрація тригліцеридів (на 136 %, 41,0 % і 76,5 % через 1, 2 і 3 місяці відповідно), вміст сечовини (на 38,0 % і 30,0 % через 2 і 3 міс. відповідно) та активність ферментів — АлАт (на 52,8%) і ЛФ (на 38,1 %) через 3 міс. Концентрація кальцію збільшувалась у самців (на 63,6 %) та самок через 1 і 2 міс., на 101,2 % і на 16,5 % відповідно.
На четвертому місяці дослідження, після відновного періоду, у тварин, що отримували максимальну дозу 7-гідроксикумарину відбувалася часткова нормалізація досліджених біохімічних показників крові. У тварин обох статей була підвищеною концентрація сечовини в сироватці крові (на 80 % у самців і 85 % самок). У самців зберігалося підвищення активності АлАт (на 20 %) і ЛФ (на 95 %). У самок залишався підвищеним вміст тригліцеридів у сироватці крові (на 45,5 %).
Встановлено, що за субхронічної дії 7-гідроксикумарину в досліджуваних дозах упродовж всього експерименту змін таких показників сечі, як питома вага, концентрація креа-тиніну, глюкози, сечовини та хлоридів не відбувалось. Як видно з таблиці 2, зміни біохімічних показників сечі піддослідних щурів обох статей виявлені тільки на 3 місяці експерименту. Концентрація білка в сечі зростала у самок — на 116 %, 150 % і 433 %, у самців — на 42 %, 171 % і 200 % за дії речовини в дозах 50, 200 і 500 мг/кг, відповідно. Показник pH сечі знижувався у самок на 6,1 %, 13,9 % і 15,4 % при дії 7-гідроксикумарину при всіх дозах, у порядку зростання. У самців зниження даного показника (на 11 %) спостерігалося тільки за діїї максимальної дози речовини. Після відновного періоду змін параметрів сечі у тварин, що зазнали впливу 7-гідроксикумарину в дозі 500 мг/кг, не виявлено.
Таблиця 2
Зміни біохімічних показників сечі щурів під впливом 7-гідроксикумарину
Таким чином, дані клініко-біохімічного дослідження cвідчать про те, що 7-гідроксикумарин в діапазоні доз 50-500 мг/кг справляє гепатотоксичну та нефротоксичну дію. Гепатотоксична дія проявляється порушенням показників обміну ліпідів (підвищення рівня тригліцеридів) та вуглеводів (гіпоглікемія). Нефротоксична дія характеризується протеїнурією, порушенням рН сечі, а також ушкодженням фільтраційної функції нирок, про що свідчить підвищення концентраціїї сечовини в сироватці крові.
Аналіз статевих відмінностей дії 7-гідроксикумарину за даними біохімічних досліджень показав, що на початку дослідження у самців і самок, спостерігається зниження концентрації глюкози в крові. У самок у цей період підвищується рівень тригліцеридів у крові, тоді як у самців рівень тригліцеридів не зазнає впливу протягом всього експерименту. В подальшому (2 та 3 місяці) у самців рівень глюкози нормалізуються, проте зростає активність ферментів АлАт і ЛФ при дії максимальної дози. А у самок відбувається поступове наростання змін біохімічних показників сироватки крові протягом всього дослідження при дії всього діапазону доз. У самців і самок максимальні зміни клініко-біохімічних показників крові спостерігаються через 3 місяці дослідження при дії речовини в максимальній дозі, проте у самок відбувається порушення більшого спектра показників, зокрема для них є характерним зниження рівня глюкози і підвищення вмісту тригліцеридів, що свідчить про більшу вираженість порушень вуглеводного та ліпідного обміну.
Підвищення активності ферментів АлАт і ЛФ свідчить про ушкодження гепатоцитів і спостерігається у тварин обох статей в кінці дослідження (3 місяці), проте у самців воно спостерігається тільки при дії максимальної дози 7-гідроксикумарину, а у самок активність ферментів підвищується при дії всього діапазону доз.
Зміни біохімічних показників свідчать про більшу вираженість гепатотоксичного ефекту 7-гідроксикумарину у самок, що підтверджують результати морфологічного і гістопатологічного дослідження печінки.
Відносна маса печінки у самців вірогідно зростала при дії препарату у дозі 200 мг/кг та 500 мг/кг і становила відповідно 4,71±0,09% і 4,76±0,23% (контроль — 3,92±0,14%) маси тіла тварин. У самок щурів відносна маса печінки вірогідно збільшувалась при всіх дозах і становила при 50 мг/кг — 4,97±0,13%, 200 мг/кг — 5,02±0,19%, 500 мг/кг — 4,92±0,37% (контроль — 3,08±0,10% ) маси тіла.
Мікроскопічне дослідження печінки показало, що у самців щурів зміни відбуваються переважно у перипортальній зоні печінкових часточок. При дії препарату у дозі 50 мг/кг у цій зоні з'являються окремі клітини з невеликою кількістю вакуолей. Доза 200 мг/кг викликає збільшення кількості вакуолізованих клітин. Гепатоцити містять велику кількість округлих вакуолей різних розмірів, що є ознакою жирової дистрофії. Структурні зміни у печінці самців щурів, що були виявлені під впливом менших доз, при дії 7-гідроксикумарину в дозі 500 мг/кг стають більш вираженими. У перипортальній зоні печінкової часточки розширюється площа, яку займають вакуолізовані клітини, зростає кількість вакуолей у гепатоцитах та їх розміри. В поодиноких випадках з'являється невелика кількість дрібних еозинофільних гепатоцитів. Мікроциркуляторне русло, переважно у перипортальній зоні, при дії всіх доз реагує звуженням синусоїдних гемокапілярів. У самок гістопатологічні зміни також спостерігаються при дії 7-гідроксикумарину в дозах 50-500 мг/кг, але вони є більш вираженими, ніж у самців. На відміну від самців у них немає зональних відмінностей щодо реакції гепатоцитів. Як у центролобулярній, так і у перипортальній зонах печінкової часточки відбуваються однакові зміни: гепатоцити розбухлі, містять велику кількість дрібних вакуолей. Спостерігається значне кровонаповнення судин. Синусоїдні гемокапіляри звужені, переповнені форменими елементами крові, що свідчить про застійні явища у кровоносній системі печінки. Ступінь змін наростає із збільшенням дози.
Отже, за гістологічними ознаками 7-гідроксикумарин викликає помірну жирову дистрофію печінки та порушення її мікроциркуляторного русла в обох статей щурів. Однак у самців ці зміни відбуваються переважно у перипортальній зоні, а у самок — в обох зонах печінкової часточки.
Відомо, що характерною особливістю для щурів у нормі є наявність статевих відмінностей щодо будови морфофункціональної одиниці печінки — печінкової часточки. Статеві особливості у будові печінки проявляються у розмірах синусоїдних гемокапілярів, просвіт яких у самців більший, ніж у самок. Таким чином, статеві розбіжності щодо прояву гепатотоксичної дії 7 гідроксикумарину можуть бути наслідком морфофункціональних відмінностей печінки у самців та самок щурів, зокрема мікроциркуляторних особливостей печінкової часточки.
За даними гістопатоморфологічного дослідження, так само як і клініко-біохімічного, так і статевих відмінностей у реакції нирок щурів дослідження на вплив 7-гідроксикумарину в усіх дозах не виявлено. 7-гідроксикумарин у дозі 200 мг/кг і вище викликає значні порушення структури нирок у самок і самців щурів, не однаково виражені у різних особин. При дії препарату у дозі 200 мг/кг незначна частина клубочків зморщується, епітеліальні клітини проксимальних канальців набухають. Відмічено незначне розширення просвіту дистальних канальців та зниження висоти їх епітелію. Із збільшенням дози до 500 мг/кг відбувається поглиблення змін у нирках. Відбувається набухання та вакуолізація клітин епітелію, проксимальниц канальців, що призводить до зменшення їх просвіту. Місцями спостерігається лізис апікальної частини епітеліоцитів, а також лізис частини ядер. Епітелій дистальних канальців зазнає ще більших структурних порушень, ніж епітелій проксимальних канальців. Значний відсоток клітин має зруйновану апікальну частину, залишки деформованих ядер сконцентровані біля базальної мембрани. Частина епітелію дистальних канальців зруйнована повністю. В збірних трубочках мозкового шару нирки висота епітелію зменшується.
Мікроскопічне дослідження серцевого м'яза показало, що 7-гідроксикумарин у дозах 50 мг/кг та 200 мг/кг викликає незначне витончення кардіоміоцитів самців щурів. У міокарді самок під впливом двох менших доз препарату помітних змін не виявлено, окрім незначного зменшення кровонаповнення судин. При дії 7-гідроксикумарину в дозі 500 мг/кг статеві відмінності у реакції міокарда щурів на препарат зникають. У самців і самок відбувається витончення кардіоміоцитів. Вони розміщуються менш щільно, ніж у контролі. Одночасно збільшуються проміжки між пучками м'язових волокон. Зменшується кровонаповнення судин мікроциркуляторного русла серця в обох статей щурів.
7-гідроксикумарин у дозах 50 мг/кг і 200 мг/кг не спричиняє помітних структурних змін у легенях самців і самок щурів. Доза 7-гідроксикумарину 500 мг/кг у самців щурів викликає потовщення міжальвеолярних перегородок. Епітеліальні клітини альвеолярної стінки набувають кубічної форми. Ядра респіраторних альвеолоцитів овальні або навіть округлі. У самок відбуваються такі ж зміни у легенях, але вони менше виражені. Таким чином, респіраторний відділ легень самців щурів більш чутливий до впливу 7-гідроксикумарину порівняно із самками.
У кишечнику після впливу 7-гідроксикумарину в дозі 50 мг/кг у щурів обох статей подекуди відбувається розширення верхніх частин ворсинок, збільшується кровона-повнення судин у цьому місці. Доза 200 мг/кг як у самок, так і у самців викликає появу булавовидних ворсинок, в місцях розширення яких спостерігається застій лімфи та повнокрів'я судин. Кінці ворсинок подовжені, заповнені сполучною тканиною. Після впливу 7-гідроксикумарину у дозі 500 мг/кг спостерігається помітне видовження ворсинок та зменшення глибини кишкових крипт. Тонкі та видовжені кінці ворсинок заповнені сполучною тканиною, вони не містить кровоносних та лімфатичних судин. Подекуди спостерігаються невеликі осередки запалення: збільшення кількості лейкоцитів у епітеліальному шарі. Спостерігається повнокрів'я судин ворсинок та застійні явища у лімфатичних судинах. У стромі ворсинок з'являється підепітеліальний набряк. Це свідчить про зниження обмінних процесів між абсорбційними клітинами та кров'ю. Отже, 7-гідроксикумарин призводить до застійних явищ у кровоносних та лімфатичних судинах слизової оболонки тонкої кишки та підепітеліального набряку.
В мозку, селезінці, наднирниках, гонадах, шлунку змін під впливом 7-гідроксикумарину в обох статей щурів не виявлено.
Після відновного періоду в усіх органах спостерігається зникнення гістопатологічних змін, що були викликані впливом 7-гідроксикумарину в максимальній дозі.
Висновки
1. 7-гідроксикумарин при субхронічному інтрагастральному введенні в діапазоні доз 50-500 мг/кг справляє дозозалежну загальнотоксичну дію на організм щурів самців та самок, що проявляється, переважно, ураженням печінки, нирок, кишечнику, меншою мірою — міокарда.
2. Гепатотоксична дія 7-гідроксикумарину проявляється у щурів самців та самок в усьому діапазоні досліджених доз та характеризується порушенням вуглеводного та ліпідного обміну, жировою дистрофією гепатоцитів, змінами мікроциркуляції в печінці, що викликає звуження синусоїдних капілярів.
3. Нефротоксична дія 7-гідроксикумарину характеризується ушкоджуючим впливом на клубочкові та канальцеві структури, внаслідок чого порушується концентраційна та видільна функції нирок.
4. 7-гідроксикумарин викликає помірні кардіодистрофічні зміни, помірні запальні процеси у слизовій оболонці кишечнику та слабкий вплив на структурні елементи респіраторного відділу щурів.
5. Виявлено статеву відмінність гепатотоксичної та кардіотоксичної дії 7-гідроксикумарину в експерименті на щурах. Ураження печінки, за біохімічними показниками та морфологічними ознаками, сильніше проявляється у самок щурів. За даними гістопатологічного дослідження у щурів самців кардіотоксична дія дослідженої речовини більша, ніж у самок.
ЛІТЕРАТУРА
1. Міщенко О.Я. Вивчення впливу засобу "Поллентар" на стан центральної нервової системи у щурів / О.Я. Міщенко // Фармак. та лікар. токсикол. — 2008. — №5-6. — С. 20-23.
2. Волощук Н.І. Порівняльна оцінка нефротоксичної дії диклофенаку натрію, німесуліду та целекоксибу у самців та самиць щурів та нефропротективна дія препаратів флаваноїдів та ізофлаваноїдів / Н.І.Волощук // Фармак. та лікар. токсикол. — 2008. — №5-6. — С. 68-73.
3. Colby H. D. Regulation of hepatic drug and steroid metabolism by androgens and estrogens // H. D. Colby / Advances in Sex Hormone Research. — 1980. — № 4. —Р. 27-71.
4. Benedito M.A. Gender differences in the activities of aspirin-esterases in rat tissues / M A. Benedito // Braz. J. Med. Biol. Res. — 1998. — Vol. 31, N 9. — P. 1113-1118.
5. Половые различия по биохимическим показателям крови у различных видов лабораторных животных/ М.Л. Малинин, Е.И. Тихомирова, Л.Б. Обух [и др.] // Известия Саратовского университета. Сер. Химия. Биология. Экология. — 2008. — Т. 8, вып. 1. — С. 51-54.
6. Oral anticoagulant treatment with coumarin derivatives does not influence plasma homocysteine concentration / H.Willems , M. den Heijer, W. Gerrits [et al.] // Europ. J. Inter. Med. — 2007 —Vol. 17, N 2. — P. 120-124.
7. A novel nonpeptide HIV-1 protease ingibitor:elucidation of binding mode and its application of the desing of related analogs / E.A. Lunney, S.E. Hagen, J.M. Domagala [et al.] // J. Med. Chem. — 1994. —V.37, №17. — P. 2664-2677.
8. Сараф А.С. Поиск нових противоаллергических соединений в ряду производных кумарина и изучение механизмов действия / А.С. Сараф, А.В. Симонян, Э.Т. Оганесян// Эксперим. и клинич. фармакология. — 1993. — Т. 56, № 2. — С. 47-50.
9. Lowry O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.I. Rosenbrougn, A.L. Farr, R.I. Randall // J. Biol. Chem. —1951. —Vol. 193. —P. 265-275.
10. Атлас патологической гистологии/ Н.Е. Ярыгин, В.В. Серов — М.: Медицина, 1977 . — 200 с.
11. Ramesh B.Antihyperlipidemic and antidiabetic effects of umbelliferone in streptozotocin diabetic rats / B. Ramesh , K.V. Pugalendi // Yale J. Biol Med. — 2005. — V.78. — №4. — P. 189-196.
12. Lake B.G. Coumarin metabolism toxicity and carcinogenicity: relevance for human risk assessment ./ B.G. Lake B.G. // Food and Chemical Toxicology. —1999. — № 37. — P. 423-453.
REFERENCES
1. Mischenko O.Ya. Vyvchennya vplyvu zasobu "Pollentar" na stan central'noi nervovoi systemy u schuriv / O.Ya. Mischenko // Farmak. ta likar. toksykol. — 2008. — №5-6. — S. 20-23.
2. Voloschuk N.I. Porivnyal'na ocinka nefrotoksychnoi dii dyklofenaku natriyu, nimesulidu ta celekoksybu u samciv ta samyc' schuriv ta nefroprotektyvna diya preparativ flavanoidiv ta izoflavanoidiv / N.I.Voloschuk // Farmak. ta likar. toksykol. — 2008. — №5-6. — S. 68-73.
3. Colby H. D. Regulation of hepatic drug and steroid metabolism by androgens and estrogens // H. D. Colby / Advances in Sex Hormone Research. — 1980. — № 4. —Р. 27-71.
4. Benedito M.A. Gender differences in the activities of aspirin-esterases in rat tissues / M A. Benedito // Braz. J. Med. Biol. Res. — 1998. — Vol. 31, N 9. — P. 1113-1118.
5. Polovye razlichiya po biokhimicheskim pokazatelyam krovi u razlichnykh vidov laboratornykh zhivotnykh/ M.L. Malinin, E.I. Tikhomirova, L.B. Obukh [i dr.] // Izvestiya Saratovskogo universiteta. Ser. Khimiya. Biologiya. Ekologiya. — 2008. — T. 8, vyp. 1. — S. 51-54.
6. Oral anticoagulant treatment with coumarin derivatives does not influence plasma homocysteine concentration / H.Willems , M. den Heijer, W. Gerrits [et al.] // Europ. J. Inter. Med. — 2007 —Vol. 17, N 2. — P. 120-124.
7. A novel nonpeptide HIV-1 protease ingibitor:elucidation of binding mode and its application of the desing of related analogs / E.A. Lunney, S.E. Hagen, J.M. Domagala [et al.] // J. Med. Chem. — 1994. —V.37, №17. — P. 2664-2677.
8. Saraf A.S. Poisk novikh protivoallergicheskikh soedinenij v ryadu proizvodnykh kumarina i izuchenie mekhanizmov dejstviya / A.S. Saraf, A.V. Simonyan, E.T. Oganesyan// Eksperim. i klinich. farmakologiya. — 1993. — T. 56, № 2. — S. 47-50.
9. Lowry O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.I. Rosenbrougn, A.L. Farr, R.I. Randall // J. Biol. Chem. —1951. —Vol. 193. —P. 265-275.
10. Atlas patologicheskoj gistologii/ N.E. Yarygin, V.V. Serov — M.: Medicina, 1977 . — 200 s.
11. Ramesh B.Antihyperlipidemic and antidiabetic effects of umbelliferone in streptozotocin diabetic rats / B. Ramesh , K.V. Pugalendi // Yale J. Biol Med. — 2005. — V.78. — №4. — P. 189-196.
12. Lake B.G. Coumarin metabolism toxicity and carcinogenicity: relevance for human risk assessment ./ B.G. Lake B.G. // Food and Chemical Toxicology. —1999. — № 37. — P. 423-453.
Надійшла до редакції 13.07.2010 р.