Розробка нових засобів лікування онкологічних захворювань є одним з пріоритетних напрямків медицини і фармації [1-4]. Проте широке використання ліків-цитостатиків в онкологічній практиці обмежується їх загальною токсичною дією на організм хворого [5, 7, 9]. Численними дослідженнями доведено, що порушуються функції серцево-судинної, сечостатевої, нервової та інших систем організму за впливу антрациклінових антибіотиків. Препарат, який найчастіше застосовується для лікування онкохворих — це доксорубіцин. Хоча загальновідомо, що Доксорубіцину властива висока загальнотоксична і, зокрема, кардіотоксична дія. Навіть у терапевтичних дозах доксорубіцин спричиняє деструктивно-дистрофічні зміни у міокарді тварин, а при використанні високих доз Доксорубіцину смертність сягає 67% [5, 7, 9].
Пошук нових інноваційних протипухлинних лікарських засобів із низькою загальною токсичністю на сьогодні залишається актуальним питанням медичної онкології. Перспективними об’єктами такого пошуку є похідні 4-тіазолідинону [13, 15]. Інтерес до цього класу гетероциклічних сполук викликаний високою фармакологічною ефективністю, низькою токсичністю «малих молекул» вказаного ряду, а також можливістю різнопланової хімічної модифікації базового підходу. Одним із перспективних напрямків створення протипухлинних агентів на основі тіазолідинової «матриці» є синтез неконденсованих похідних шляхом поєднання тіазолідинону з рядом фармакологічно привабливих гетероциклів, зокрема піразоліновим [14] та індоліновим [10]. Зазначений підхід дозволив ідентифікувати ряд високоактивних сполук серед тіазолідино-піразолінів [11] та піразоліно-індолів [12], що володіли вираженим антинеопластичним ефектом in vitro на окремі лінії пухлинних клітин людини.
Відомо, що дія лікарських засобів з високою біологічною активністю може супроводжуватись виникненням різних за проявом і ступенем тяжкості побічних реакцій. Тому необхідним є дослідження безпечності дії потенційних ліків [1, 4, 5]. Однією з вимог до потенційних лікарських засобів є оптимальне співвідношення між їхньою ефективністю дії та токсичністю [3, 4]. Небажані прояви дії слід враховувати не лише під час доклінічних випробувань, але й у процесі медичного застосування нових лікарських засобів [3, 4]. Вивчення біобезпечності потенційних ліків, зокрема гострої токсичності, є одним із обов’язкових етапів розробки нових лікарських препаратів [3, 4, 6].
Мета дослідження. Визначити токсичність нових синтетичних сполук із антинеопластичною активністю Les-3882, Les-3288, Les-3833 у білих лабораторних щурів при їхньому одноразовому введенні (“гостра токсичність“) порівняно з токсичністю відомого протипухлинного препарату Доксорубіцину. Дослідити кумулятивні властивості сполук Les-3882, Les-3288, Les-3833.
Матеріали і методи. Дослідження проведені відповідно до Наказу МОЗ України №944 від 14.12.2009 р. «Про затвердження порядку проведення доклінічного вивчення лікарських засобів та експертизи матеріалів доклінічного вивчення лікарських засобів» і діючих методичних рекомендацій [4, 6, 8].
В експериментах використовували сполуки Les-3882, Les-3288, Les-3833, синтезовані на кафедрі фармацевтичної, органічної та біоорганічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (стуктура досліджуваних сполук наведена у попередніх роботах [12]). Оскільки у літературі не описано структурних аналогів синтезованих сполук із антинеопластичною активністю, для порівняння використовували відомий протипухлинний препарат «Доксорубіцин» («Arterium», Україна).
Вивчення гострої токсичності препарату. За умов гострого досліду визначали величину токсичних доз досліджуваних сполук і ступінь токсичності, а також концентрації препаратів для визначення їхніх кумулятивних властивостей.
Гостру токсичність протипухлинних сполук Les-3882, Les-3288, Les-3833 у порівнянні з токсичністю Доксорубіцину вивчали на білих щурах 3-4-місячного віку із масою тіла 165-180 г. Досліджувані препарати вводили у шлунок тваринам за допомогою металевого зонду для лабораторних тварин натще, одноразово. Тваринам контрольної групи вводили відповідну дозу фізіологічного розчину. Всього у дослідах було використано 126 білих щурів. Доксорубіцин вводили тваринам у дозі 40, 50, 60, 70, 80 мг/кг, а протипухлинні сполуки Les-3882 — у дозі 200, 225, 250, 275, 300 мг/кг, Les-3288 — у дозі 200, 220, 240, 260, 280, 300 мг/кг, Les-3833 — у дозі 70, 90, 110, 130, 150 мг/кг.
Спостереження за лабораторними тваринами проводили протягом 14 діб після введення відповідного препарату. Враховували зовнішній вигляд та особливості поведінки тварин, інтенсивність і характер їхньої рухової активності, ритм, частоту дихання, ставлення до прийому корму і води. Окрім цього, оцінювали стан шерсті та видимих слизових оболонок, реєстрували терміни виникнення і характер інтоксикацій, їхню важкість, перебіг або видужування. Під час досліду відзначали загибель лабораторних тварин і залежно від дози препарату вираховували середньосмертельну дозу (ЛД50) даної сполуки [3].
Вивчення кумулятивних властивостей. Кумуляцію протипухлинних сполук Les-3882, Les-3288, LES-3833 порівняно з кумуляцією Доксорубіцину вивчали у 48 білих щурів масою 150-170 г. Щури були поділені на 2 групи: контрольну і дослідну. Для визначення ступеня кумуляції препарату використали метод К.С. Ліма [9]. Препарати вводили тваринам щоденно, натще, внутрішньошлунково одноразово за допомогою металевого зонду для лабораторних щурів. Дослід тривав 8 діб у щурів, яким вводили Доксорубіцин, і 20 діб у щурів, які отримували синтетичні протипухлинні сполуки. Доксорубіцин вводили щурам, починаючи з дози 5,5 мг/кг, а Les-3882 — починаючи з дози 10,7 мг/кг, Les-3288 — з дози 24,3 мг/кг, Les-3833 — з дози 10,7 мг/кг, що становило 0,1 від максимальної введенної дози препарату в дослідах із визначення ЛД50, з послідовним збільшенням дози у 1,5 раза через кожні 4 доби.
Під час досліду враховували загальний стан і загибель щурів. ЛД50 розраховували за формулою:
ЛД50= ЛД100 – Σ (z d)/ m,
де: ЛД100 — доза, від якої загинули всі тварини; Σ — символ суми; z — половина загальної кількості тварин, які загинули від двох наступних доз; d — різниця двох наступних доз; m — кількість тварин у групі на кожну дозу.
Залежно від дози препарату вираховували коефіцієнт кумуляції за формулою, запропонованою Ю.С. Каганом і В.В. Станкевичем [3,4,9]:
Ккум = ЛД50 n / ЛД50 1,
де Ккум — коефiцiєнт кумуляцiї, ЛД50 n і ЛД50 1 — середнi смертельнi дози за багаторазового та одноразового введення відповідно.
На наступну добу після останнього введення препарату лабораторних тварин декапітували з використанням легкого ефірного наркозу, відбирали кров для проведення гематологічних і біохімічних досліджень за загальновизнаними методиками, робили розтин і визначали коефіцієнти маси органів, порівняно з контрольною групою.
Результати дослідження та їх обговорення
1. Визначення параметрів гострої токсичності За умов визначення параметрів гострої токсичності встановлено, що загибель білих щурів починалася вже на першу добу після введення препарату. Під час спостереження за тваринами відзначали пригнічення загального стану, щури були менш активні, скупчувалися у групи, відмовлялися від корму, залізали у підстилку. Результати розгорнутого досліду наведені у табл. 1.1-1.4.
Таблиця 1.1
Гостра токсичність доксорубіцину у білих щурів
Таблиця 1.2
Гостра токсичність сполуки Les-3288 у білих щурів
Таблиця 1.3
Гостра токсичність сполуки Les-3882 у білих щурів
Таблиця 1.4
Гостра токсичність сполуки Les-3833 у білих щурів
Згідно з формулою, ЛД50 = 300–(20+50+70+90+110) / 6 = 243,3 мг/кг.
Таким чином, ЛД50 сполуки Les-3288 у білих щурів за умов умов внутрішньошлункового введення становить 243,3 мг/кг.
Таким чином, ЛД50 сполуки Les-3833 у білих щурів за доочеревинного введення становить 106,7 мг/кг.
2. Дослідження кумулятивних властивостей За умов дослідження властивостей Доксорубіцину щодо кумуляції всі дослідні тварини загинули на 8 добу досліду (табл. 2.1). Сумарно введена доза препарату на одну тварину становила 50,97 мг/кг маси тіла, а коефіцієнт кумуляції становив відповідно – 0,92 що свідчить про виражені кумулятивні властивості препарату.
Таблиця 2.1
Кумулятивні властивості Доксорубіцину в білих щурів
Отже, Доксорубіцин відноситься до препаратів із вираженою здатністю до кумуляції. Коефіцієнт його кумуляції у білих щурів становить 0,92.
За умов дослідження кумуляції протипухлинних сполук Les-3882, Les-3288, Les-3833, загибелі дослідних тварин впродовж 20 діб досліду виявлено не було. Сумарно введена доза сполуки Les-3288 на одну тварину становила 1306,25 мг/кг маси тіла, сполуки Les-3882 — 1252,8 мг/кг маси тіла, а сполуки Les-3833 — 562,68 мг/кг маси тіла. Коефіцієнт кумуляції усіх досліджуваних синтетичних сполук становив 5,3, що свідчить про слабко виражені кумулятивні властивості досліджуваних препаратів.
При макроскопічному огляді внутрішніх органів щурів не виявлено ознак інтоксикації або інших проявів патології. Внутрішні органи лабораторних тварин за розміром, кольором, консистенцією і розташуванням не виходили за межі норми і не відрізнялися від внутрішніх органів групи інтактного контролю. Вірогідних відмінностей між масовими коефіцієнтами внутрішніх органів контрольної та дослідних груп не виявлено.
У рамках міжнародної програми Developmental Therapeutic Program у Національному Інституті Раку (США) ми надали використані у даній роботі сполуки для вивчення in vitro антинеопластичної активності піразолін-тіазолідинон-індолінів щодо 60-ти ліній клітин дев’яти онкозахворювань людини: лейкозу (CCRF-CEM, HL-60(TB), K-562, MOLT-4, RPMI-8226, SR), недрібноклітинного раку легені (Non-Small Cell Lung Cancer) (A549/ATCC, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522), епітеліального колоректального раку (COLO 205, HCС-2998, HCT-116, HCT-15, HT-29, KM12, SW-620), раку центральної нервової системи (SF-268, SF-295, SF-539, SNB-19, SNB-75, U251), меланоми (LOX IMVI, М14, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-28, SK-MEL-5, UACC-257, UACC-62), раку яєчника (IGROV1, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, NCI/ADR-RES, SK-OV-3), раку нирки (786-0, A498, ACHN, CAKI-1, RXF 393, SN12C, TK-10, UO-31), раку простати (PC-3, DU-145), раку молочної залози (MCF7, MDA-MB-231/ATCC, HS 578T, MDA-MB-468, BT-549, T-47D). За результатами проведеного скринінгу сполук in vitro сполук було розраховано три дозозалежні параметри: GI50 — концентрація, яка викликає пригнічення росту 50% клітин, TGI — концентрація сполуки, що створює повне пригнічення росту клітин, LC50 — концентрація речовини, що призводить до 50%-ої загибелі клітин. GI50 інтерпретують як ефективний рівень інгібування росту клітин, TGI — як рівень цитостатичного ефекту, а LC50 є летальною концентрацією, що характеризує цитотоксичну дію. Аналіз одержаних результатів у контексті «структура — протипухлинна активність» дозволив встановити важливість наявності атомів галогену в 5-у положенні індолінового циклу, що зумовлює цитостатичний ефект досліджуваних сполук у субмікромолярних концентраціях галогензаміщених індолінів (GI50 Les-3288 = 0,21 мкМ, GI50 Les-3833 = 0,071 мкМ) порівняно з 5-незаміщеними індолінами (GI50 Les-3882 = 3,16 мкМ). Слід відзначити активність сполуки Les-3833, для якої показники ефективної інгібувальної концентрації для більшості видів пухлин є на порядок меншими (GI50 < 10-7 M), порівняно з активністю інших сполук [11]. Враховуючи високу ефективність антинеопластичної дії вказаних сполук в експериментах in vitro, актуальним є токсикологічне дослідження сполук Les-3288, Les-3833 і Les-3882 in vivo. Отже, ефективність антинеопластичної дії синтезованих сполук Les-3288, Les-3833 і Les-3882 в описаних вище експериментах in vitro, у цілому узгоджується з результатами нашого токсикологічного дослідження цих сполук у лабораторних щурів. Крім того, досліди in vitro та in vivo продемонстрували, що поєднання в одній молекулі тіазолідинового, піразолінового та індолінового гетероциклів дозволяє досягти істотного підсилення їхнього цитостатичного ефекту без вираженої селективності на окремі пухлинні лінії [11].
Висновки
1. Синтетичні сполуки Les-3882 і Les-3288 належать до 3-го класу токсичності (помірно токсичні речовини) [2]. Їхні ЛД50 становлять 237,5 мг/кг і 243,3 мг/кг, відповідно, що у 4,3-4,4 раза нижче, ніж у Доксорубіцину, який, як підтверджено у нашій роботі, належить до 2-го класу токсичності (сильнотоксичні речовини) [2, 8], а його ЛД50 становить 55 мг/кг. Сполука Les-3833 належить до 2-го класу токсичності [2, 8], її ЛД50 становить 106,7 мг/кг, що лише в 1,94 раза нижче, ніж у Доксорубіцину.
2. Сполуки Les-3882, Les-3288, Les-3833 відносяться до препаратів зі слабо вираженою здатністю до кумуляції. Коефіцієнт їхньої кумуляції у білих щурів становить 5,3, у той час як Доксорубіцин володіє вираженою здатністю до кумуляції і коефіцієнт його кумуляції у білих щурів – 0,92.
ЛІТЕРАТУРА
1. Безопасность лекарств: Руководство по фармаконадзору / [под ред. А.П. Викторова, В.И. Мальцева, Ю.Б. Белоусова]. — К.: Морион, 2007. — 240 с.
2. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. — ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. — [Введ. 01.01.77]. — Переиздан 01.12.81. — М.: Изд-во стандартов, 1982. — 6 с.
3. Доклінічні дослідження ветеринарних лікарських засобів / [за ред. І.Я. Коцюмбаса].— Львів, 2006. — 359 с.
4. Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації / [за ред. О.В. Стефанова]. — К., 2001. — 527 с.
5. Зборовский А.Б. Неблагоприятные побочные эффекты лекарственных средств / А.Б. Зборовский, И.Н. Тюренков, Ю.Б. Белоусов. — М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. — 656 с.
6. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических средств / Е.В. Арзамасцев, Т.А. Гуськова, И.В. Березовская и др. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ — М., 2000. — С. 18-26.
7. Мохорт М.А. Кардіотоксичні ефекти доксорубіцину і доцільність їх фармакологічної корекції антагоністами кальцію дигідропіридинового ряду та активаторами АТФ-чутливих калієвих каналів гуанідинового ряду / М.А. Мохорт, М.Н. Серединська, Л.М. Киричок // Фармакологія і лікарська токсикологія. — 2010. — №4 (7). — С. 35-44.
8. Про затвердження порядку проведення доклінічного вивчення лікарських засобів та експертизи матеріалів доклінічного вивчення лікарських засобів: наказ МОЗ України від 14.12.2009 № 944. — Режим доступу http://zakon. rada.gov.ua/cgi-bin/laws/ main.cgi?nreg=z0053—10/
9. Семенова А.И. Кардио- и нейротоксичность противоопухолевых препаратов (патогенез, клиника, профилактика, лечение) / А.И. Семенова // Практ. онкология. — 2009. — т. 10, №3. — С. 168-176.
10. Cytotoxic and anticancer activities of isatin and its derivatives: A comprehensive review from 2000-2008 / K.L. Vine, L. Matesic, J.M. Locke [et al.] // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. — 2009. — Vol. 9. — P. 397-414.
11. Synthesis of new 4-thiazolidinone-, pyrazoline-, and isatin-based conjugates with promising antitumor activity / Havrylyuk D., Zimenkovsky B., Vasylenko O. [et al.] // J. Med. Chem. — 2012. — Vol. 55. — P. 8630-8641.
12. Synthesis and anticancer activity of isatin-based pyrazolines and thiazolidines conjugates / Havrylyuk D., Kovach N., Zimenkovsky B. [et al.] // Arch. Pharm. Chem. Life Sci. — 2011. — Vol. 344. — P. 514-522)
13. Lesyk R. 4-Thiazolidones: Centenarian History, Current Status and Perspectives for Modern Organic and Medicinal Chemistry / R. Lesyk, B. Zimenkovsky // Curr. Org. Chem. — 2004. — Vol. 8. — P. 1547-1577.
14. Shaaban M. R. Recent advances in the therapeutic applications of pyrazolines / M. R. Shaaban, A. S. Mayhoub, A. M. Farag // Expert Opin. Ther. Patents. — 2012. — Vol. 22, №.3. — Р. 253-291.
15. Verma A. 4-Thiazolidinone — A biologically active scaffold / A. Verma, S.K. Saraf // European Journal of Medicinal Chemistry. — 2008. — Vol. 43. — Р. 897-905.
REFERENCES
1. Bezopasnost' lekarstv: Rukovodstvo po farmakonadzoru / [pod red. A.P. Viktorova, V.I. Mal'ceva, Yu.B. Belousova]. — K.: Morion, 2007. — 240 s.
2. Vrednye veschestva. Klassifikaciya i obschie trebovaniya bezopasnosti. — GOST 12.1.007-76. SSBT. — [Vved. 01.01.77]. — Pereizdan 01.12.81. — M.: Izd-vo standartov, 1982. — 6 s.
3. Doklinichni doslidzhennya veterynarnykh likars'kykh zasobiv / [za red. I.Ya. Kocyumbasa].— L'viv, 2006. — 359 s.
4. Doklinichni doslidzhennya likars'kykh zasobiv. Metodychni rekomendacii / [za red. O.V. Stefanova]. — K., 2001. — 527 s.
5. Zborovskij A.B. Neblagopriyatnye pobochnye effekty lekarstvennykh sredstv / A.B. Zborovskij, I.N. Tyurenkov, Yu.B. Belousov. — M.: OOO «Medicinskoe informacionnoe agentstvo», 2008. — 656 s.
6. Metodicheskie ukazaniya po izucheniyu obschetoksicheskogo dejstviya farmakologicheskikh sredstv / E.V. Arzamascev, T.A. Gus'kova, I.V. Berezovskaya i dr. // Rukovodstvo po eksperimental'nomu (doklinicheskomu) izucheniyu novykh farmakologicheskikh veschestv — M., 2000. — S. 18-26.
7. Mokhort M.A. Kardiotoksychni efekty doksorubicynu i docil'nist' ikh farmakolohichnoi korekcii antahonistamy kal'ciyu dyhidropirydynovoho ryadu ta aktyvatoramy ATF-chutlyvykh kalievykh kanaliv huanidynovoho ryadu / M.A. Mokhort, M.N. Seredyns'ka, L.M. Kyrychok // Farmakolohiya i likars'ka toksykolohiya. — 2010. — №4 (7). — S. 35-44.
8. Pro zatverdzhennya poryadku provedennya doklinichnoho vyvchennya likars'kykh zasobiv ta ekspertyzy materialiv doklinichnoho vyvchennya likars'kykh zasobiv: nakaz MOZ Ukrainy vid 14.12.2009 № 944. — Rezhym dostupu http://zakon. rada.gov.ua/cgi-bin/laws/ main.cgi?nreg=z0053—10/
9. Semenova A.I. Kardio- i nejrotoksichnost' protivoopukholevykh preparatov (patogenez, klinika, profilaktika, lechenie) / A.I. Semenova // Prakt. onkologiya. — 2009. — t. 10, №3. — S. 168-176.
10. Cytotoxic and anticancer activities of isatin and its derivatives: A comprehensive review from 2000-2008 / K.L. Vine, L. Matesic, J.M. Locke [et al.] // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. — 2009. — Vol. 9. — P. 397-414.
11. Synthesis of new 4-thiazolidinone-, pyrazoline-, and isatin-based conjugates with promising antitumor activity / Havrylyuk D., Zimenkovsky B., Vasylenko O. [et al.] // J. Med. Chem. — 2012. — Vol. 55. — P. 8630-8641.
12. Synthesis and anticancer activity of isatin-based pyrazolines and thiazolidines conjugates / Havrylyuk D., Kovach N., Zimenkovsky B. [et al.] // Arch. Pharm. Chem. Life Sci. — 2011. — Vol. 344. — P. 514-522)
13. Lesyk R. 4-Thiazolidones: Centenarian History, Current Status and Perspectives for Modern Organic and Medicinal Chemistry / R. Lesyk, B. Zimenkovsky // Curr. Org. Chem. — 2004. — Vol. 8. — P. 1547-1577.
14. Shaaban M. R. Recent advances in the therapeutic applications of pyrazolines / M. R. Shaaban, A. S. Mayhoub, A. M. Farag // Expert Opin. Ther. Patents. — 2012. — Vol. 22, №.3. — Р. 253-291.
15. Verma A. 4-Thiazolidinone — A biologically active scaffold / A. Verma, S.K. Saraf // European Journal of Medicinal Chemistry. — 2008. — Vol. 43. — Р. 897-905.
Надійшла до редакції 25.11.2013 р.