В.І. Жуков, Н.Г. Щербань, А.І. Безродна, Н.А. Ващук, С.А. Стеценко
Харківський національний медичний університет, м. Харків
РЕЗЮМЕ. Метою роботи є дослідження загальної токсичності та впливу на організм теплокровних тварин субтокстних доз олігоефірів: Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80 та вивчення структурно-метаболічного стану печінки та її детоксифікаційної функції. Опігоефіри в дозі 1/10 ЛД50 викликають в організмі теплокровних значні структурно-метаболічні порушення в печінці, які поєднані з її детоксикаційною функцією. В дозі 1/100 ЛД50 ксенобіотики приводили до активації метаболічних процесів і функції детоксикації. В дозі 1/1000 ЛД50 олігоефіри не впливали на метаболічну активність і детоксикаційну функцію печінки. Аналіз оціночних показників свідчить, що тривала дія Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80 стимулює в організмі дослідних тварин вільнорадикальні процеси, перекисне окислення ліпідів призводить до виснаження антиоксидантної системи і порушень білкового, вуглеводного, ліпідного і нуклеїнового обміну, які в комплексі здатні формувати вільнорадикальну мембранну патологію, яка є провідним ланцюгом розвитку дистрофічних процесів у печінці та пригніченні детоксшсаційної функції.
Ключові слова: прості олігоефіри, метаболізм, резистентність, токсичність, довкілля.
Сьогодні віддалені наслідки майже безконтрольного скиду стічних вод у водойми та викидів в атмосферне повітря хімічної, нафтопереробної, фармацевтичної, електрохімічної, металургійної промисловості, а також використання у побуті великого асортименту хімічних засобів створило умови для інтенсивного забруднення навколишнього, виробничого та побутового середовища.
Прямим наслідком цього є численні приклади інтенсивного забруднення об'єктів довкілля населених місць і зниження загальної популяційної резистентності організму людини, що створює умови для виникнення широкого спектра захворювань. У системі пошуку та визначення профілактичних заходів з проблеми захисту здоров'я населення значну роль відіграє оперативна діагностика порушення гомеостатичної функції організму на ранніх етапах розвитку захворювань і патологічних станів. Методологічною основою при цьому може бути розробка і обґрунтування критеріально значимих показників, що віддзеркалюють молекулярно-мембранну патологію, яка є підгрунтям формування більшості екологічно обумовлених захворювань і патологічних станів [1].
У зв'язку з цим актуальним є вивчення механізмів біологічної дії та етапів структурно-метаболічних порушень, які виникають в організмі за впливу антропогенного хімічного навантаження, а також розробка засобів і принципів профілактики порушення гомеостатичної функції організму та її корекції [1]. Відомо, що значна кількість хімічних сполук володіє мембранотропною дією, формує розвиток вільнорадикальної патології, пригнічує клітинний і гуморальний імунітет, здійснює мутагенні, гонадотоксичні та ембріотоксичні ефекти [2–4]. Це повного мірою стосується нових хімічних сполук, зокрема органічного синтезу олігоефірів на основі двох і трьохатомних спиртів.
Актуальність проблеми вивчення цих хімічних речовин обумовлена великими обсягами виробництва, широким асортиментом продукції на їхній основі та відсутністю прогностичної характеристики потенційної небезпеки для людини. Саме це і визначає необхідність вивчення механізмів біологічної дії та патофізіологічних основ формування структурно-метаболічних порушень в організмі при тривалому впливі цих нових марок олігоефірів. У зв'язку з вищенаведеним, метою роботи є дослідження загальної токсичності та впливу на організм теплокровних тварин субтоксичних доз олігоефірів: Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80 та вивчення структурно-метаболічного стану печінки та її детоксикаційної функції.
Матеріали та методи дослідження. У роботі були використані олігоефіри на основі етиленгліколю і гліцерилу, які мають товарну назву «Лапроли» марок: Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. «Лапрол» 3603-2-12 (поліоксипропіленоксіетилентріол) — прозора, в'язка рідина, добре розчинна у воді, бензолі, толуолі, спиртах, має молекулярну масу 3600, питома щільність при 25°С — 1,03 г/см3. «Лапрол» Л-10002-2-80 (поліоксіетиленоксипропілендіол) — прозора, в'язка рідина, добре розчинна у воді та органічних розчинниках, молекулярної маси 10000, питома щільність при 25°С — 1,1 г/см3.
Програма дослідження передбачала проведення підгострого токсикологічного експерименту на білих щурах і вивчення впливу олігоефірів на показники структурно-метаболічного стану печінки і функцію детоксикації. Статевозрілі шури популяції WAG масою 190–200 г піддавалися щоденному пероральному впливу ксенобіотиків протягом 45 діб. Для цього водні розчини олігоефірів у дозах 1/10, 1/100 і 1/1000 ЛД50 вранці натщесерце за допомогою металевого зонду вводились внутрішньошлунково. Контрольна група тварин отримувала відповідні об'єми питної води. За результатами гострого токсикологічного експерименту Л-3603-2-12 відноситься до помірнотоксичних, а Л-10002-2-80 — до малотоксичних сполук, відповідно 3-й та 4-й клас безпеки. Середньолетальні дози ЛД50 були визначені для щурів на рівні 3,34 і 38,4 г/кг маси тварин відповідно для Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Коефіцієнти кумуляції (Кк) знаходилися на рівні 10,9 і 6,14 для Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Всі етапи наукового експерименту виконувалися відповідно до правил гуманного ставлення до тварин і вимог «Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, що застосовуються в науковому експерименті» — Страсбург, 1986.
Вивчення детоксикаційної функції печінки проводилося за наступними показниками: оцінка активності сульфатної, глутатіонової, глюкуронідної та ацетильної кон’югацій, стану системи оксидатно-антиоксидатної взаємодії і динамічних порушень білкового, вуглеводного, нуклеїнового і жирового обміну.
У зв'язку з поставленими завданнями вміст кетонових тіл у крові щурів визначали шляхом зв'язування ацетону саліциловим методом [5]. Неестерифіковані вільні жирні кислоти в плазмі крові визначали за екстракцією мідних солей жирних кислот органічними розчинниками [5]. Глікоген у печінці визначався методом Зейфтера [6]. Активність УДФ-глюкуронілтрансферази мікросомальної фракції печінки оцінювалася за швидкістю кон’югації паранітрофенолу [7, 8], N-ацетилтрансферази в постмітохондріальній фракції — за швидкістю кон’югації параамінобензойної кислоти, кількість якої вимірювали за реакцією діазосполучення з N-нафтамінетилендіаміном [91. Активність глутатіон-S-трансферази оцінювалася за утворенням кон’югатів глутатіону з 1-хлор-2,4-динітробензолом [10, 11]. Сумарний вміст КоА визначали методом ацетилювання параамінобензойної кислоти [11]. Вміст відновленого і окисленого глутатіону визначали в глутатіон-трансферазній реакції [12]. Цистеїн — за реакцією з нінгідрином у трихлороцтовому фільтраті [13]. Сумарну РНК виділяли фенольно-термічним методом [14]. Ядра із гепатоцитів виділяли за методом D.M. Gill [15], глобуліни — за методом Б.І. Збарського і Г.П. Георгієва [16], пістони — за методом E.W. Johns, A.V. Butter [17]. Про відносний рівень вторинних продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) робили висновок за накопиченням малонового діальдегіду (МДА), який визначали по Ю.А. Володимирову і О.І. Арчакову [18]. Дієнові кон’югати визначали спектрофотометричним методом [19]. Глюкозу, холестерин, креатинін, сечовину, аспарагінову (АСАТ) і аланінову амінотрансферази (АСАТ), триптофан-2,3-діоксигеназу визначали загальноприйнятими методами [6, 7]. Активність глюкозо-6-фосфатази (Г-6-Фаза) визначалась в печінці за методом, описаним А.А. Покровським і О.I. Арчаковим [20]. Для статистичної оцінки групових відмінностей використовувався параметричний t-критерій Стьюдента-Фішера.
Результати дослідження та їх обговорення. За результатами досліджень Л-3603-2-12 в 1/10 ДЛ50 знижував активність у мікросомах гепатоцитів УДФ-глюкуронілтрансферази і вміст загальних, зв язаних і вільних глюкуронідів (табл. 1). У цій дозі ксенобіотик пригнічував активність арилсульфаттрансферази в постмітохондріальній фракції і вміст у печінці загальних і зв'язаних сульфатів на фоні збільшення вільних сульфатів. N-ацетилтрансферазна активність у постмітохондріальній фракції знижувалася і знижувався загальний вміст у тканині печінки КоА. Активність глутатіон-S-трансферази в постмітохондріальній фракції гепатоцитів знижувалася на фоні підвищення в печінці окисленого і зменшення відновленого глутатіону. Сірковмісна амінокислота за цієї дози зменшувалася в тканині печінки. Динамічні зміни оціночних показників під впливом 1/100 ЛД50 мали в більшості випадків протилежну спрямованість. Вони характеризувалися підвищенням активності УДФ-глюкуронілтрансферази, арилсульфаттрансферази, N-апетилтрансферази, глутатіон-8-трансферази. Ці зміни супроводжувалися зростанням загальних, зв язаних і вільних глюкуронідів і сульфатів.
Таблиця 1. Вплив поліоксипропіленоксіетилентріолу Л-3603-2-12 на детоксикаційну функцію печінки в підгострому експерименті
Результати, які наведено в табл. 1, свідчать, що Л-3603-2-12 у дозі 1/100 ЛД50 підвищує вміст КоА в печінці на 135,98, відновленого глутатіону на 37,32%, окисленого глутатіону на 78,12% і цистеїну на 60,71%. Аналіз оціночних показників детоксикаційної функції печінки свідчить про те, що тривала субтоксична дія ксенобіотика має виразну дозову залежність: в 1/10 ЛД50 «Лапрол» Л-3603-2-12 пригнічує детоксикаційну функцію печінки, в 1/100 ЛД50 ксенобіотик навпаки суттєво активує ці процеси, що необхідно розглядати як захисно-пристосувальну реакцію організму на ушкоджуючу дію. В 1/1000 ЛД50 Л-3603-2-12 не впливає на детоксикаційну функцію печінки.
Дослідження детоксикаційної функції печінки під впливом Л-10002-2-80 виявили пригнічення фази кон’югації у групи щурів, токсифікованих 1/10 ЛД50, і підвищення функціональної активності печінки за тривалої субтоксичної дії 1/100 ЛД50. В 1/1000 ЛД50 олігоефір не впливав на структурно-метаболічні процеси, які пов’язані з механізмами знешкодження ксенобіотика (табл. 2).
Вплив Л-10002-2-80 у підгострому експерименті на детоксикаційну функцію печінки
Проте слід відзначити, шо Л-10002-2-80 у порівнянні з впливом Л-3603-2-12 менше пригнічував активність ферментів УДФ-глюкуронілтрансферази, арилсульфотрансферази, N-ацетилтрансферази і глутатіонтрансферази під впливом 1/10 ЛД50. Але в дозі 1/100 ЛД50активність Л-10002-2-80 була значно вища порівняно з Л-3603-2-12. З досвіду багатьох вчених з метою обґрунтування механізмів біологічної дії ксенобіотиків найбільш виправданим і раціональним є використання речовин у дозі 1/100 ЛД50, тобто тієї дози, яка викликає значні структурно-метаболічні порушення при тривалій токсифікації. Ця доза і була нами використана під час дослідження впливу ксенобіотиків на метаболічні процеси в печінці в умовах підгострого експерименту. Оцінка впливу олігоефірів на структурно-метаболічні процеси в печінці виявила підвищення вмісту малонового діальдегіду (МДА) і дієнів у гомогенатах цього органа, креатиніну і сечовини в сироватці і крові на фоні значного зниження глікогену (табл. 3). Так, вміст МДА підвищувався на 104,37% і 79,23%, дієнові кон’югати — на 68,34% і 48,72%, креатинін на — 67,34% і 49,71%, сечовина — на 150,0% і 100,58%, а вміст глікогену знижувався на 81,82% і 73,35%, відповідно під впливом Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Дослідження в печінці РНК, глобулінів і пістонів виявили суттєве зниження їх вмісту у порівнянні з групою контрольних тварин: РНК знижувалася на 53,68% і 41,75%, глобуліни — на 37,36% і 29,23%, пістони — на 42,69% і 34,87%, відповідно під впливом Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Вміст вільних жирних кислот і кетонових тіл у сироватці крові зростали: жирні кислоти — на 158,46% і 106,15%, кетонові тіла — на 532,35% і 423,52% відповідно у груп тварин токсифікованих Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Вміст глюкози в крові знижувався на 52,94% і 45,87 під впливом Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80.
Таблиця 3. Вплив ксенобіотикдв у дозі 1/100 ЛД50 на структурно-метаболічні процеси в печінці в умовах тривалої субтоксичної дії (М±m)
Одержані результати добре узгоджуються з динамікою активності глюкозо-6-фосфатази, вміст якої знижувався на 74,0% і 62,11% відповідно при токсифікації Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Вміст холестерину в сироватці крові підвищувався на 108,4% і 94,36% під впливом Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80.
Дослідження активності органоспецифічних ферментів виявили підвищення в печінці АЛАТ, АCАТ і зниження Т-2,3-ДО: АЛАТ підвищувалась на 398,24% і 326,31%, АСАТ на 411,11% і 338,88%, тоді як триптофандіоксигеназа знижувалася на 61,32% і 49,76%, відповідно у груп токсифікованих Л-3603-2-12 і JI-10002-2-80.
Висновок. За результатами проведених досліджень можна зробити висновок, що олігоефіри в дозі 1/10 ЛД50 викликають в організмі теплокровних значні структурно-метаболічні порушення в печінці, які поєднані з її дeтоксикаційною функцією. В дозі 1/100 ЛД50ксенобіотики призводили до активації метаболічних процесів і функції детоксикації. В дозі 1/1000 ЛД50 олігоефіри не впливали на метаболічну активність і детоксикаційну функцію печінки. Аналіз оціночних показників свідчить, що тривала дія Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80 стимулює в організмі дослідних тварин вільнорадикальні процеси, перекисне окислення ліпідів призводить до виснаження антиоксидантної системи і порушень білкового, вуглеводного, ліпідного і нуклеїнового обміну, які в комплексі здатні формувати вільнорадикальну мембранну патологію, яка є провідним ланцюгом розвитку дистрофічних процесів у печінці та пригніченні детоксикаційної функції.
ЛІТЕРАТУРА
1. Биохимические механизмы радиомиметических эффектов поверхностно-активных веществ / Н.Г. Щербань. В.И. Жуков, В.В. Мясоедов [и др.] — Харьков: «Раритеты Украины», 2012. — 120 с.
2. Простые и макроцикличсскис эфиры: научные основы охраны водных объектов / В.И. Жуков, Л.Д. Попова, О.В. Зайцева [и др.] — Харьков: «Торнадо», 2000. — 438 с.
3. Медико-биологические аспекты проблемы охраны водных объектов от загрязнения поверхностно-активными веществами / В.И. Жуков, Р.И. Кратенко, Ю.К. Резуненко [и др.] — Харьков: «Торнадо», 2000. — 394 с.
4. Детергенты — модуляторы радиомиметических эффектов / В.И. Жуков, В.В. Мясоедов, Ю.И. Козин [и др.] — Белгород, 2000. — 376 с.
5. Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике / А.А. Покровский. — М: Медицина, 1969. — 652с.
6. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / под ред. проф. В.В. Меншикова. — М: Медицина, 1987. — 368 с.
7. Асатини В.С. Биохимическая фотометрия / B.C. Асатини. — М: Издательство академии наук СССР, 1957. — 836 с.
8. Burcliell В. 4-Nitrophenol UDP-glucoronyltransferase / В. Burcliell. P. Weatheril // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 169–171.
9. Weber W.W. N-acetyltransferese and Aiylhydroxamic Acid acyltransferese / W.W. Weber, G.M. King // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 272–281.
10. Habig W.H. Assays for differentiations of glutatlwne-S-transferase / W.H. Habig, W.B. Jacobi // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 398–405.
11. Экспериментальная витаминология / под ред. Ю.М. Островского. — Минск: Наука и техника, 1979. — 550 с.
12. Asaoka К. An enzymatic assay of reduced glutatione using glutatione-S-arvltransferase with O-dinitrobenzene as a substrate / K. Asaoka, K. Takashi // J. Biochem. — 1981. — V. 90, №5. — P. 1237–1242.
13. Gaitоnde M.K. A spectrophotometric method for direkt determination of cystcinc, m the prcscncc of other naturally occuring aminoacid / M.K. Caitonde // J. Biochem. — 1967. —V. 104, №2. — P. 627–633.
14. Георгиев Г.П. Информационная и рибосомалвная рибонуклеиновые кислоты хромосомно-ядрышкового аппарата, методы разделения и нуклеиновый состав / Г.П. Георгиев, В.П. Мантьева // Биохимия. — 1962. — Т. 27. — С. 949–957.
15. Gill D.M. An improved method for isolation of rat liver nuclei bv dengity centrifugation / D.M. Gill // J. Cell. Biology. — 1965. — V. 24. — P. 157–161.
16. Збарский Б.И. Новые данные по функционированию клеточных ядер печени крыс и химическому составу ядерных структур / Б.И. Збарский, Г.П. Георгиев // Биохимия. — 1959. — Т. 24., Вып. 2. — С. 192–199.
17. Jong Е.V. Father fractionarmg of histones from calf thymus / E.V. Jong, A.V. Butter // Biochemical J. — 1962. — V. 82. №1. — P. 15–18.
18. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. — М: Медицина, 1972. — 236 с.
19. Косухин А.Б. Экстракция липидов смесью гептан-изопропанол для определения диеновых конъюгатов / А.Б. Kocvxин, Б.С. Ахметова // Лаб. дело. — 1987. — №5. — С. 335–337.
20. Покровский А.А, Методы разделения и ферментной идентификации субклеточных фракций / А.А. Покровский, А.И. Арчаков. Современные методы в биохимии. — М: Медицина, 1968. — С. 5–59.
REFERENCES
1. Biokhimicheskie mekhanizmy radiomimeticheskikh effektov poverkhnostno-aktivnykh veschestv / N.G. Scherban'. V.I. Zhukov, V.V. Myasoedov [i dr.] — Khar'kov: «Raritety Ukrainy», 2012. — 120 s.
2. Prostye i makrociklichsskis efiry: nauchnye osnovy okhrany vodnykh ob'ektov / V.I. Zhukov, L.D. Popova, O.V. Zajceva [i dr.] — Khar'kov: «Tornado», 2000. — 438 s.
3. Mediko-biologicheskie aspekty problemy okhrany vodnykh ob'ektov ot zagryazneniya poverkhnostno-aktivnymi veschestvami / V.I. Zhukov, R.I. Kratenko, Yu.K. Rezunenko [i dr.] — Khar'kov: «Tornado», 2000. — 394 s.
4. Detergenty — modulyatory radiomimeticheskikh effektov / V.I. Zhukov, V.V. Myasoedov, Yu.I. Kozin [i dr.] — Belgorod, 2000. — 376 s.
5. Pokrovskij A.A. Biokhimicheskie metody issledovaniya v klinike / A.A. Pokrovskij. — M: Medicina, 1969. — 652s.
6. Laboratornye metody issledovaniya v klinike. Spravochnik / pod red. prof. V.V. Menshikova. — M: Medicina, 1987. — 368 s.
7. Asatini V.S. Biokhimicheskaya fotometriya / B.C. Asatini. — M: Izdatel'stvo akademii nauk SSSR, 1957. — 836 s.
8. Burcliell В. 4-Nitrophenol UDP-glucoronyltransferase / В. Burcliell. P. Weatheril // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 169–171.
9. Weber W.W. N-acetyltransferese and Aiylhydroxamic Acid acyltransferese / W.W. Weber, G.M. King // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 272–281.
10. Habig W.H. Assays for differentiations of glutatlwne-S-transferase / W.H. Habig, W.B. Jacobi // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 398–405.
11. Eksperimental'naya vitaminologiya / pod red. Yu.M. Ostrovskogo. — Minsk: Nauka i tekhnika, 1979. — 550 s.
12. Asaoka К. An enzymatic assay of reduced glutatione using glutatione-S-arvltransferase with O-dinitrobenzene as a substrate / K. Asaoka, K. Takashi // J. Biochem. — 1981. — V. 90, №5. — P. 1237–1242.
13. Gaitоnde M.K. A spectrophotometric method for direkt determination of cystcinc, m the prcscncc of other naturally occuring aminoacid / M.K. Caitonde // J. Biochem. — 1967. —V. 104, №2. — P. 627–633.
14. Georgiev G.P. Informacionnaya i ribosomalvnaya ribonukleinovye kisloty khromosomno-yadryshkovogo apparata, metody razdeleniya i nukleinovyj sostav / G.P. Georgiev, V.P. Mant'eva // Biokhimiya. — 1962. — T. 27. — S. 949–957.
15. Gill D.M. An improved method for isolation of rat liver nuclei bv dengity centrifugation / D.M. Gill // J. Cell. Biology. — 1965. — V. 24. — P. 157–161.
16. Zbarskij B.I. Novye dannye po funkcionirovaniyu kletochnykh yader pecheni krys i khimicheskomu sostavu yadernykh struktur / B.I. Zbarskij, G.P. Georgiev // Biokhimiya. — 1959. — T. 24., Vyp. 2. — S. 192–199.
17. Jong Е.V. Father fractionarmg of histones from calf thymus / E.V. Jong, A.V. Butter // Biochemical J. — 1962. — V. 82. №1. — P. 15–18.
18. Vladimirov Yu.A. Perekisnoe okislenie lipidov v biologicheskikh membranakh / Yu.A. Vladimirov, A.I. Archakov. — M: Medicina, 1972. — 236 s.
19. Kosukhin A.B. Ekstrakciya lipidov smes'yu geptan-izopropanol dlya opredeleniya dienovykh kon'yugatov / A.B. Kocvxin, B.S. Akhmetova // Lab. delo. — 1987. — №5. — S. 335–337.
20. Pokrovskij A.A, Metody razdeleniya i fermentnoj identifikacii subkletochnykh frakcij / A.A. Pokrovskij, A.I. Archakov. Sovremennye metody v biokhimii. — M: Medicina, 1968. — S. 5–59.
Надійшла до друку 4.09.2015 p.