Резюме. Мета. Визначити пріоритетні критерії впливу сукцинаміду за умов інтраназального надходження до організму експериментальних тварин.
Матеріали та методи. Проведено 20-денне інтраназальне введення сукцинатвмісного антидіабетичного засобу щурам у дозах 6,7 та 1 мг/мл, що відповідає порогу гострої (Limac) та хронічної (Limch) інгаляційної дії. Досліджено стан процесів: пероксидного окиснення ліпідів за рівнем дієнових кон'югатів, гідроперекисей ліпідів та активних сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою, антиоксидантного захисту за активністю глутатіонзалежних ферментів, а також активності каталази та супероксиддисмутази.
Результати та обговорення. Встановлено, що в крові тварин відбувається підвищення активності каталази сироватки крові та глутатіонпероксидази гемолізату еритроцитів. У тканині печінки, навпаки, відзначали деяке послаблення ферментативного антипероксидного захисту у вигляді падіння активності каталази та глутатіонпероксидази, яке сприяє накопиченню проміжних продуктів ліпопероксидації у вигляді ГПЛ. Компенсаторне підвищення активності глутатіон-трансферази в тканині печінки стабілізує процеси ПОЛ, що сприяє зниженню рівня кінцевих продуктів ліпопероксидації.
Висновки. Показники ПОЛ та АОЗ (активність каталази сироватки крові, концентрація ТБКАС і ГПЛ гомогенату печінки, активність ГП, ГР гемолізату еритроцитів, T-S-трансферази гомогенату печінки) можна розглядати як пріоритетні критерії впливу сукцинатвмісного антидіабетичного засобу при інтраназальному надходженні до организму на рівнях Limac и Limch.
Ключові слова: антидіабетичний засіб, перекисне окиснення ліпідів, антиоксидантний захист, біомаркери ефекту.
Введение. Химико-фармацевтическая промышленность, как известно, является одной из материалоемких отраслей и по данным международной классификации Агентства по охране окружающей среды США относится к группе экологически опасных предприятий [1]. В связи с этим работа в условиях воздействия потенциально опасных соединений является фактором риска для здоровья работающего контингента и возникновения профессиональной патологии [2].
В современных условиях экономической нестабильности и ухудшения санитарноэпидемиологического надзора за условиями труда в Украине снижается уровень производственной безопасности, в том числе и в фармацевтической отрасли [3].
На химико-фармацевтических предприятиях при синтезе и изготовлении готовых лекарственных средств (ЛС) одномоментно могут присутствовать в воздухе рабочей зоны различные по характеру действия органические и неорганические вещества, способные оказывать комбинированное действие на организм работающих [4]. Химические вещества, в том числе и ЛС, могут поступать в организм работающих через неповрежденные кожные покровы, слизистые оболочки, органы пищеварения. Однако основной и наиболее агрессивный путь попадания в организм ЛС в условиях производства — через дыхательные пути [5].
Выбранное для исследования сукцинат-содержащее антидиабетическое средство β-фенилэтиламид 2-оксисукцинаниловой кислоты — β-ФЭА-ОСАК, синтезированное в ГУ «Институт проблем эндокринной патологии НАМН Украины» (г. Харьков), помимо антигипергликемического и антиоксидантного эффекта способно оказывать стимулирующее действие на регенерацию и секреторную функцию панкреатических β-клеток, препятствуя их деструкции диабетогенными факторами, снижает риск развития диабетических микро- и макроангиопатий в условиях относительной или абсолютной инсулиновой недостаточности [6]. В настоящее время на одном из отечественных предприятий планируется его промышленный выпуск, поэтому всестороннее исследование его влияния на здоровый организм является актуальным.
Одна из приоритетных задач современной профилактической медицины — интенсивный поиск объективных, чувствительных и информативных ранних маркеров нарушений в состоянии здоровья работающих, отражающих перестройки в основных звеньях метаболических превращений в условиях производственного воздействия химических факторов [7].
Исследованиями последних лет установлено, что окислительно-восстановительные процессы, главным образом, баланс между образованием свободных радикалов и механизмами антиоксидантной защиты во многом определяет стабильность гомеостаза живого организма [8].
Воздействие на организм работающих химических факторов, в том числе ЛС в условиях их промышленного выпуска, может способствовать активации эндогенных механизмов свободнорадикального окисления и приводить к напряжению в системе антиоксидантной защиты с последующим развитием окислительного стресса. Во многих публикациях, посвященных поиску критериев ранней и специфической донозологической диагностики профессиональной патологии, инициированной ЛС, отводится первостепенная роль именно состоянию проантиоксидантного гомеостаза, как пускового механизма развития патологии различного генеза [9].
Цель. Определить приоритетные критерии влияния изучаемого сукцинамида в условиях интраназального поступления в организм экспериментальных животных.
Материалы и методы. Эксперименты проведены на 30 половозрелых, нелинейных крысах-самцах массой тела 200–260 г, содержащихся в соответствии с «Общими этическими принципами экспериментов на животных» (Украина, 2001) [10].
Проведено 20-дневное интраназальное моделирование ингаляционного пути введения: животным вводили водную эмульсию субстанции β-ФЭА-ОСАК с твин-80 в дозах 6,7 и 1 мг/мл, что в перерасчете соответствует порогу острого (Limac) и хронического (Limch) ингаляционного действия [11]. Контрольная группа животных получала интраназально стерильный физиологический раствор в количестве 0,3 мл/кг. Для проведения биохимических исследований получали биосубстрат: кровь, плазму крови, сыворотку крови, ткань печени.
Процессы свободнорадикального пероксидного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК), гидроперекисей липидов (ГПЛ) и активных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБКАС), в сыворотке крови, цельной крови и гомогенате печени [12–14]; антиоксидантный статус организма животных изучали, исходя из активности глутатионзависимых ферментов — глутатионредуктазы (ГР) (КФ 1.6.4.2), глутатионпероксидазы (ГП) (КФ 1.11.1.9), глутатионтрансферазы (ГТ) (КФ 2.5.1.18) в гемолизате эритроцитов и гомогенате печени [15]. Кроме этого, определяли каталазную активность (КФ 1.11.1.6) сыворотки крови и гомогената печени, активность супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1) в гомогенате печени [16–17]. В качестве вспомогательных характеристик для расчета активности ферментов в гемолизате эритроцитов определяли концентрацию общего гемоглобина [18].
Нормальность распределения в рядах определяли по критерию Шапиро-Уилка (W). Для парного сравнения показателей подопытной группы с интактным контролем использовали критерий Стьюдента. Фактический материал обрабатывали с помощью пакета программного обеспечения StatSoft 10 [19].
Результаты и обсуждение. Анализируя показатели системы пероксидного окисления липидов в условиях интраназального поступления субстанции β-ФЭА-ОСАК в дозе 6,7 мг/мл, соответствующей Limac, в сыворотке крови подопытных животных по сравнению с контролем выявлена активация только первичных реакций ПОЛ в виде ДК при отсутствии изменений интенсивности других окислительных реакций каскадного процесса (табл.).
Таблица. Некоторые показатели липопероксидации и антиоксидантной защиты у крыс в условиях интраназального введения антидиабетического средства, (X±Sx)
Примечания: 1) отклонение статистически достоверно, (р<0,05); 2) отклонение статистически близко к достоверному, (0,05<р<0,1); 3) — GSSG — глутатион окисленный; 4) — комплекс GS-2,4-динитробензол.
Следует отметить, что при введении данной дозы исследуемого соединения отсутствовали изменения в содержании промежуточных и конечных продуктов ПОЛ в крови, что, по-видимому связано с активацией каталазы сыворотки крови (p<0,05) и ГП гемолизата эритроцитов (0,05<р<0,1) у этой группы животных. Данные энзимы первой и второй линии антиоксидантной защиты препятствуют накоплению в клетках гидроперекисей и тем самым блокируют развитие цепной реакции с образованием высокотоксичных гидроксильных радикалов. Известно, что каталаза является ферментом преимущественно первого уровня антиоксидантной защиты и наиболее активна при высоких концентрациях пероксидов. Для дальнейшей инактивации активированных кислородных метаболитов при малых количествах гидроперекиси более эффективна окислительно-восстановительная ферментативная система глутатиона, в частности глутатионпероксидаза, которая катализирует разложение перекисей путем окисления [20]. Вместе с тем в группе животных, получавших интраназально β-ФЭА-ОСАК в дозе 1 мг/мл, наоборот, отмечали изолированное снижение активности ГР гемолизата эритроцитов (p<0,05), что, возможно, связано с напряжением антиокислительных процессов в системе рециклирования глутатиона и определенными перестройками в процессах конъюгации и элиминации в ответ на поступление исследуемого соединения [8].
Обращает на себя внимание более выраженная реакция печени на интраназальное введение соединения. Так, при данных условиях эксперимента в ткани печени подопытных животных на уровне обеих доз зарегистрировано ускорение скорости накопления промежуточных составляющих пероксидного окисления, в частности, повышение уровней ГПЛ с различным уровнем статистической значимости по сравнению с контролем. Значительное повышение уровня ГПЛ, вероятно, связано с выявленным у подопытной группы животных (доза 1 мг/мл) при данных условиях экспозиции снижением активности каталазы и ГП в гомогенате печени (p<0,05). При этом на конечных стадиях интенсивность липопероксидации в печени животных замедлялась, о чем свидетельствует снижение уровня конечных продуктов деградации жирных кислот ТБКАС (p<0,05) в группе животных, получавших интраназально β-ФЭА-ОСАК в дозе 6,7 мг/мл. у животных, получавших меньшую дозу, данный показатель находился на уровне контрольных значений.
Вместе с этим в гомогенате печени у подопытных животных на обоих уровнях доз отмечено существенное повышение активности глутатион-S-трансферазы.
Основная функция данного энзима — защита клеток от неблагоприятного воздействия ксенобиотиков и продуктов ПОЛ посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы глутатиона (конъюгации) или нуклеофильного замещения гидрофобных групп. Следовательно, при ослаблении активности отдельных изоферментов глутатионового ряда именно ГТ способствует нейтрализации и ускорению выведения из организма нарастающего содержания продуктов липопероксидации [21]. В данном случае, скорее всего, имеет место компенсаторное повышение активности ГТ в гомогенате печени в ответ на резкое снижение активности ГП и каталазы, направленное на сохранение проантиоксидантного баланса.
Установлено, что при моделировании ингаляционного пути поступления сукцинамида в виде интраназального введения в дозах 6,7 и 1 мг/мл в системе крови происходит активация энзимов антипероксидной защиты, что способствует блокировке каскадных реакций ПОЛ, о чем свидетельствует отсутствие изменений уровня промежуточных и конечных продуктов окислительной деградации жирных кислот в крови. В ткани печени животных снижается антиперекисная защита (падение активностей каталазы и ГП) и компенсаторно повышается активность ГТ, что, в свою очередь, приводит к замедлению и стабилизации накопления конечных продуктов ПОЛ.
Выводы. Таким образом, показатели ПОЛ и АОЗ (активность каталазы сыворотки крови, концентрация ТБКАС и ГПЛ гомогената печени, активность ГП, ГР гемолизата эритроцитов, ГТ гомогената печени) можно рассматривать как приоритетные критерии влияния β-ФЭА-ОСАК при интраназальном поступлении в организм на уровне Limac и Limch.
Литература
1. Буров Ю.И. Проблемы экологической безопасности человека в химико-фармацевтической промышленности / Ю.И. Буров — М.: Медицина. 1995. — 365 с.
2. Кундиев Ю.И. Химическая опасность в Украине и меры по ее предупреждению / Ю.И. Кундиев, И.М. Трахтенберг // Журнал АМН Украины. — 2004. — № 2. — С. 259–267.
3. Александрова Л.Г. До проблеми гігієнічного контролю за забрудненням виробничого середовища хімічними речовинами / Л.Г. Александрова // Укр. журнал з пробл. медицини праці. — 2011. — № 1. — С. 71–81.
4. Тарасова Н.И. Методические и методологические проблемы охраны труда и промышленной безопасности / Н.И. Тарасова, В.И. Козлов // Вестник Кузбасского государственного технического университета. — 2012. — № 3(91). — С. 120–124.
5. Малютина Н.Н. Патофизиологические и клинические аспекты воздействия метанола и формальдегида на организм человека / Л.А. Тараненко // Современные проблемы науки и образования. — 2014. — №2. — С. 1–11.
6. Горбенко Н.І. Патогенетичне обґрунтування ефективності похідного янтарної кислоти — фенсукциналу в терапії цукрового діабету та його судинних ускладнень (експериментальне дослідження): авто-реф. дис. ... на здобуття наук.ступеня д-ра біол. наук: спец. 14.01.14 / Горбенко Наталія Іванівна. — Інститут проблем ендокринной патології ім. В.Я. Данилевського АМН України. — Х., 2004. — 36 с.
7. Измеров Н.Ф. Охрана здоровья рабочих и профилактика профессиональных заболеваний на современном этапе / Н.Ф. Измеров // Медицина труда и промышленная экология. — 2002. — № 1. — С. 1–7.
8. Чеснокова Н.П. Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, Н.М. Бизенкова // Успехи современного естествознания. — 2006. — № 7. — С. 29–36.
9. Изучение окислительного метаболизма в профпатологии (обзор литературы) / В.А. Кирьянов [и др.] // Медицина труда и пром. экология. — 2004. — № 4. — С. 22–26.
10. Загальні етичні принципи експериментів на тваринах // Ендокринологія. — 2003. — Т. 8, № 1. — С. 142–145.
11. МВ 1.1.5-121-2005 Методичні вказівки з обгрунтування ГДК лікарських засобів у повітрі робочої зони і атмосферному повітрі населених місць // МОЗ України; Державна санітарно-епідеміологічна служба. — Київ. — 2005. — 30 с.
12. Плацер З. Определение диеновых конъюгатов и общих гидроперекисей в биологических материалах / З. Плацер, М. Видлакова, Л. Купила // Чехосл. мед. обзор. — 1970. — Т. 16, № 1. — С. 30–34.
13. Asakawa T. Colorings conditions of thiobarbituric acid test for detecting lipid hydroperoxides / T. Asakawa, S. Matsushite // Lipids. — 1980. — Vol. 15. — Р. 137–140.
14. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Соврем. методы в биохимии. — М.: Медицина. — 1977. — С. 66–68.
15. Арутюнян А.В. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: метод. рекомендации / Рос. акад. мед. наук; авт. А.В. Арутюнян [и др.]. — СПб., 2000. — С. 76.
16. Мишенева В.С. Наличие глютатиона в нормальных и опухолевых тканях человека и животных / В.С. Мишенева, Т.А. Горюхина // Вопр. онкологии. — 1968. — Т. 14, № 10. — С. 46–49.
17. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Маёрова, В.Е. Токарев // Лаб. дело. — 1988. — № 1. — С. 16–19.
18. Методы качественного и количественного спектрофотометрического анализа гемоглобина и его дериватов в эритроцитах и плазме крови / М.С. Кушаковский // Клинические формы повреждения гемоглобина. — Л., 1968. — С. 9–80.
19. Пакет программного обеспечения для статистического анализа StatSoft Statistic 10.0.
20. Горожанская Э.Г. Свободнорадикальное окисление и механизмы антиоксидантной защиты в нормальной клетке и при опухолевых заболеваниях / Э.Г. Горожанская // Клиническая лабораторная диагностика. — 2010. — № 6. — С. 20–44.
21. Землянова М.А. Современные подходы к оценке нарушений метаболизма ксенобиотиков при поступлении в организм из внешней среды / М.А. Землянова, Ю.В. Кольдибекова // Экология человека. — 2012. — № 8. — С. 8–14.
REFERENCES
1. Burov Yu.I. Problemy ekologicheskoj bezopasnosti cheloveka v khimiko-farmacevticheskoj promyshlennosti / Yu.I. Burov — M.: Medicina. 1995. — 365 s.
2. Kundiev Yu.I. Khimicheskaya opasnost' v Ukraine i mery po ee preduprezhdeniyu / Yu.I. Kundiev, I.M. Trakhtenberg // Zhurnal AMN Ukrainy. — 2004. — № 2. — S. 259–267.
3. Aleksandrova L.H. Do problemy hihiyenichnoho kontrolyu za zabrudnennyam vyrobnychoho seredovyscha khimichnymy rechovynamy / L.H. Aleksandrova // Ukr. zhurnal z probl. medycyny praci. — 2011. — № 1. — S. 71–81.
4. Tarasova N.I. Metodicheskie i metodologicheskie problemy okhrany truda i promyshlennoj bezopasnosti / N.I. Tarasova, V.I. Kozlov // Vestnik Kuzbasskogo gosudarstvennogo tekhnicheskogo universiteta. — 2012. — № 3(91). — S. 120–124.
5. Malyutina N.N. Patofiziologicheskie i klinicheskie aspekty vozdejstviya metanola i formal'degida na organizm cheloveka / L.A. Taranenko // Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. — 2014. — №2. — S. 1–11.
6. Horbenko N.I. Patohenetychne obgruntuvannya efektyvnosti pokhidnoho yantarnoi kysloty — fensukcynalu v terapii cukrovoho diabetu ta joho sudynnykh uskladnen' (eksperymental'ne doslidzhennya): avto-ref. dys. ... na zdobuttya nauk.stupenya d-ra biol. nauk: spec. 14.01.14 / Horbenko Nataliya Ivanivna. — Instytut problem endokrynnoj patolohii im. V.Ya. Danylevs'koho AMN Ukrainy. — Kh., 2004. — 36 s.
7. Izmerov N.F. Okhrana zdorov'ya rabochikh i profilaktika professional'nykh zabolevanij na sovremennom etape / N.F. Izmerov // Medicina truda i promyshlennaya ekologiya. — 2002. — № 1. — S. 1–7.
8. Chesnokova N.P. Molekulyarno-kletochnye mekhanizmy inaktivacii svobodnykh radikalov v biologicheskikh sistemakh / N.P. Chesnokova, E.V. Ponukalina, N.M. Bizenkova // Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya. — 2006. — № 7. — S. 29–36.
9. Izuchenie okislitel'nogo metabolizma v profpatologii (obzor literatury) / V.A. Kir'yanov [i dr.] // Medicina truda i prom. ekologiya. — 2004. — № 4. — S. 22–26.
10. Zahal'ni etychni pryncypy eksperymentiv na tvarynakh // Endokrynolohiya. — 2003. — T. 8, № 1. — S. 142–145.
11. MV 1.1.5-121-2005 Metodychni vkazivky z obhruntuvannya HDK likars'kykh zasobiv u povitri robochoi zony i atmosfernomu povitri naselenykh misc' // MOZ Ukrainy; Derzhavna sanitarno-epidemiolohichna sluzhba. — Kyiv. — 2005. — 30 s.
12. Placer Z. Opredelenie dienovykh kon'yugatov i obschikh gidroperekisej v biologicheskikh materialakh / Z. Placer, M. Vidlakova, L. Kupila // Chekhosl. med. obzor. — 1970. — T. 16, № 1. — S. 30–34.
13. Asakawa T. Colorings conditions of thiobarbituric acid test for detecting lipid hydroperoxides / T. Asakawa, S. Matsushite // Lipids. — 1980. — Vol. 15. — Р. 137–140.
14. Stal'naya I.D. Metod opredeleniya malonovogo dial'degida s pomosch'yu tiobarbiturovoj kisloty / I.D. Stal'naya, T.G. Garishvili // Sovrem. metody v biokhimii. — M.: Medicina. — 1977. — S. 66–68.
15. Arutyunyan A.V. Metody ocenki svobodnoradikal'nogo okisleniya i antioksidantnoj sistemy organizma: metod. rekomendacii / Ros. akad. med. nauk; avt. A.V. Arutyunyan [i dr.]. — SPb., 2000. — S. 76.
16. Misheneva V.S. Nalichie glyutationa v normal'nykh i opukholevykh tkanyakh cheloveka i zhivotnykh / V.S. Misheneva, T.A. Goryukhina // Vopr. onkologii. — 1968. — T. 14, № 10. — S. 46–49.
17. Korolyuk M.A. Metod opredeleniya aktivnosti katalazy / M.A. Korolyuk, L.I. Ivanova, I.G. Maerova, V.E. Tokarev // Lab. delo. — 1988. — № 1. — S. 16–19.
18. Metody kachestvennogo i kolichestvennogo spektrofotometricheskogo analiza gemoglobina i ego derivatov v eritrocitakh i plazme krovi / M.S. Kushakovskij // Klinicheskie formy povrezhdeniya gemoglobina. — L., 1968. — S. 9–80.
19. Paket programmnogo obespecheniya dlya statisticheskogo analiza StatSoft Statistic 10.0.
20. Gorozhanskaya E.G. Svobodnoradikal'noe okislenie i mekhanizmy antioksidantnoj zaschity v normal'noj kletke i pri opukholevykh zabolevaniyakh / E.G. Gorozhanskaya // Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. — 2010. — № 6. — S. 20–44.
21. Zemlyanova M.A. Sovremennye podkhody k ocenke narushenij metabolizma ksenobiotikov pri postuplenii v organizm iz vneshnej sredy / M.A. Zemlyanova, Yu.V. Kol'dibekova // Ekologiya cheloveka. — 2012. — № 8. — S. 8–14.
Надійшла до редакції 10.07.2016 р.