О.Г. Пихтєєва, кандидат хім. наук
Український НДІ медицини транспорту МОЗ України, м. Одеса, Україна
РЕЗЮМЕ. В експерименті на лабораторних мишах при одноразовому введенні досліджені токсикокінетика і токсикодинаміка хлориду кадмію та комплексу кадмію з металотіонеіном (Cd7-MT). Показано, що при введенні цих сполук індукція синтезу МТ у печінці та нирках, а також токсикокінетика і токсикодинаміка кадмію значно різняться. Доведено, що немае достатніх підстав вважати комплекс кадмію з металотіонеіном відповідальним за нефротоксичну дію. Вказано на необхідність проведення додаткових досліджень для вивчення різних аспектів впливу зв'язування металів з МТ на клітинні механізми токсичної дії важких металів.
Ключові слова: металотіонеїн, кадмій, токсикокінетика.
Протягом останніх двох десятиріч особливу увагу в токсикології важких металів привертає транспорт важких металів у біосистемах, в першу чергу його клітинні ланки [1]. Серед ключових білків клітинного металотранспорту одне з провідних місць посідають металотіонеїни (МТ) [2, 3]. Цей транспортний білок відноситься до категорії не тільки найпоширеніших у тваринному і рослинному світі, а й міститься у представників видів, що мають різний історичний вік і знаходяться на різних еволюційних щаблях. Для членів сімейства металотіонеїнів характерне поєднання високого динамізму (адаптивності) з підвищеною стійкістю до зовнішніх впливів (термостабільність, здатність до зворотного окислення) [4].
Основна фізіологічна функція МТ полягає в транспорті цинку, забезпеченні його гомеостазу та біодоступності у місцях синтезу ключових ферментів. Завдяки наявності у складі МТ семи координаційних центрів, які здатні високоселективно зв’язувати іони d10 металів (Zn2+, Cd2+, Hg2+, Cu+, Ag+), МТ проявляє детоксикаційні властивості. Саме ці важкі метали є основними індукторами синтезу МТ [5].
Попри численні дослідження з проблеми МТ, залишаються не до кінця з’ясованими механізми його антитоксичної дії, недостатньо вивчені питання токсикокінетики та токсикодинаміки металокомплексів цього білка з кадмієм.
Мета роботи. Вивчення особливостей та порівняння токсикокінетики та токсикодинаміки CdCl2 та екзогенного комплексу кадмію з металотіонеіном при інтраперитонеальному введенні лабораторним мишам
Матеріали та методи
Експеримент проведено в лабораторії промислової та екологічної токсикології ДП «Український НДІ медицини транспорту». Лабораторних тварин одержували з віварію Одеського національного медичного університету, який обладнаний відповідно до існуючих санітарно-гігієнічних норм. Усіх дослідних тварин утримували в стандартних санітарних умовах при t=20–24 °С, вологості 50–55 %, природному світловому режимі «день–ніч», на збалансованому харчовому раціоні відповідно до діючих норм. Усі дослідження відповідали правилам «Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та наукових цілей».
Дослідження проведені на статевозрілих безпородних мишах з вихідною масою 20–22 г. Для виділення МТ на першій стадії дослідження у щура вагою 300 г внутрішньочеревним (в/о) введенням хлориду кадмію в дозі 0,5 мг/кг (по солі) був викликаний індуктивний синтез МТ. За добу після введення CdCl2 тварину виводили з експерименту під хлороформним наркозом та виділяли печінку, яку гомогенізували в попередньо стерилізованій бідистильованій воді. З отриманого гомогенату виділяли низькомолекулярну білкову фракцію, що містить МТ, яку обробляли надлишком кадмію і витримували 1 годину для утворення комплексу Cd7-MT (тобто до повного насичення). Потім надлишок кадмію видаляли співосадженням з карбонатом кальцію. В результаті отримали розчин, що містить комплекс Cd7-MT. У аліквоті цього розчину визначили вміст кадмію, який становив 51,6 мкг/мл. Тварин утримували в стандартних умовах віварію з вільним доступом до їжі та води, що попередньо досліджувались на вміст ВМ. У жодному випадку вміст Zn, Cu, Hg, Cd не виходив за межі допустимих значень у харчових продуктах згідно з МБТ «Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов» [6] та ДсанШН 2.2.4-171-10 "Гігієнічні вимоги до води питної, призначеної для споживання людиною" [7]).
Результата та їхнє обговорення
Для вивчення токсикокінетики і токсикодинаміки розподілу кадмію та синтезу МТ при одноразовому інтраперитонеальному введенні був проведений наступний експеримент. Білі миші масою 18–20 г були поділені на 2 групи по 18 тварин у кожній. Тваринам першої групи одноразово в/о вводили кадмій у вигляді CdCl2, другої — комплекс Cd7-MT в однаковій дозі 0,25 мг/кг по металу. Три інтактні миші служили контролем. Тварин виводили з експерименту через 1, 3, 6, 12, 24, 72, 120 годин з дотриманням правил біоетики. У тварин виділяли печінку і нирки. У зв'язку з малими масами органів пробу по 3 тваринах усереднювали. В отриманій пробі визначали вміст кадмію та МТ. Залежність накопичення кадмію та концентрація МТ в органах представлена на рис. 1.
Рис. 1. Динаміка зміни концентрації кадмію в нирках та печінці при одноразовому в/о введенні кадмію білим мишам у вигляді CdCI2 або Cd7-MT у однаковій дозі 0,25 мг/кг по металу
З рис. 1 видно, що вид кінетичної кривої розподілу кадмію в органах залежить від введеної сполуки. Дійсно, максимум вмісту кадмію в нирках при введенні Cd7-MT спостерігається значно раніше, ніж при введенні CdCl2. У печінці спостерігається протилежна картина. Але, вже через 72 години різниця в концентраціях зменшується і тенденція до згладжування відмінностей зберігається через 120 годин.
Якщо вміст металів у органах-мішенях при одноразовому введенні проходить через максимум і має тенденцію до досить швидкого зниження, то кінетика синтезу МТ має дещо іншу картину (рис. 2). Так, у нирках спостерігається досить швидке (вже через 6, а особливо 12 годин) зростання концентрації МТ при введенні Cd7-MT.
Рис. 2. Динаміка зміни концентрації МТ в нирках та печінці при одноразовому в/о введенні кадмію білим мишам у вигляді CdCI2 або Cd7-MT в одинаковій дозі 0,25 мг/кг по металу
На жаль, наш метод визначення МТ не дозволяє розрізнити екзогенний і ендогенний МТ. Але розрахунок матеріального балансу з урахуванням припущення, що практично весь введений Cd7-MT спрямовується для детоксикації в нирки, показує, що при цьому концентрація екзогенного МТ могла б досягати 32 нмоль/г. Однак навіть максимальна концентрація МТ у нирках незначно перевищує 20 нмоль/г, причому з цієї кількості слід відняти синтезований de novo у відповідь на надходження кадмію і присутній на базальному рівні МТ. Цей факт може свідчити про те, що поглинання комплексу Cd7-MT з крові відбувається досить повільно. Можливо, це є однією з причин аномально довгого терміну напіввиведення кадмію з організму.
У той же час, як видно з рис. 2, в печінці активний синтез МТ при введенні CdCl2 починається вже через 6 годин, досягаючи максимуму через 72 години.
У максимальній точці кінетичної кривої концентрація МТ перевищує первісну в 18,3 раза. Через 5 діб концентрація МТ у печінці незначно знижується, але зберігається на рівні 1640 % від вмісту МТ у печінці інтактних тварин. У той же час при введенні Cd7-MT зростання концентрації МТ у печінці менш виражене, але тенденція до зростання зберігається і через 5 діб після введення. Ймовірно, при введенні комплексу Cd7-MT, незважаючи на міцне зв'язування кадмію, частково відбувається перекомплексоутворення, а також розпад і деградація метало-білкового комплексу в лізосомах, що було показано нами в попередньому експерименті.
Оскільки раніше встановлено, що лізосомальний фермент КФ може бути маркером активації лізосом, вивчено кінетику зміни активності цього ферменту в нирках. Виявилося, що після одноразового в/о введення нефротоксичної дози кадмію 0,25 мг/кг, активність КФ у нирках проходить через максимум, причому положення цього максимуму залежить від сполуки кадмію. Так, вже через 6 годин після введення CdCl2 спостерігається активація лізосомального апарату і до 24 годин відбувається достовірне (порівняно з контролем) зростання активності КФ у печінці. Проте вже через 72 години спостерігається зниження активності КФ, яке триває і через 120 годин, досягаючи 79 % базального рівня. При веденні Cd7-MT у печінці зниження активності КФ з часом не спостерігається, а незначна (але достовірна порівняно з контролем) активація має місце через 72 години. У той же час у нирках через 24 години після введення зростає активність КФ, ймовірно, викликане активацією первинних лізосом і збільшенням їх числа. Найбільше зростання відбувається при введенні Cd7-MT (на 22 % порівняно з контролем).
Через 72 години відбувається зниження активності КФ, більш виражене при введенні CdCl2, ймовірно, за рахунок інгібування ферменту при утворенні металокомплексу з кадмієм в активному центрі та витіснення з нього цинку.
Рис. 3. Кинетика зміни активності кислої фосфатази в печінці та нирках після одноразового в/о введення кадмію білим мишам у вигляді CdCI2 або Cd7-MT в одинаковій дозі 0,25 мг/кг по металу.
Таким чином, з проведених досліджень можна зробити наступні висновки:
1. Токсикокінетика та токсикодинаміка кадмію значно відрізняється при введенні неорганічної солі та екзогенного комплексу з метал отіонеїном.
2. При введенні неорганічної солі максимальне зростання концентрації кадмію спостерігається в печінці, а при введенні комплексу Cd7-MT — в нирках.
3. Утворення комплексу Cdx-MT носить помітну гепатопротекторну дію.
4. Поглинання комплексу Cd7-MT з крові відбувається досить повільно. Можливо, це є однією з причин аномально тривалого періоду напіввиведення кадмію з організму.
5. З часом відбувається метаболізація сполук кадмію (зв’язування з транспортерами, розпад комплексів Cd7-MT у лізосомах з утворенням відносно низькомолекулярних сполук тощо), що дозволяє спостерігати зниження різниці в накопиченні та токсичній дії кадмію через 5 діб після його введення у вигляді різних сполук.
ЛІТЕРАТУРА
1. Общая токсикология // Под ред. Б.А. Курляндского, В.А. Филова. — М. Медицина, 2002. — 608 с.
2. Foulkes Е.С. // Transport of Heavy Metals by the Kidney / Б.C. Foulkes // Toxicology Letters. — 1990. — V. 53, № 1–2. — P. 29–31.
3. Пыхтеева E.Г. Металлотионеин: биологические функции. Роль металлотионеина в транспорте металлов в организме / Е.Г. Пыхтеева // Актуальные проблемы транспортной медицины. — № 4 (18), 2009. — С. 44–58.
4. Шафран Л.М. Металлошонеины / Л.М. Шафран, Е.Г. Пыхтеева, Д.В. Большой / под редакцией проф. Л.М. Шафрана. — Одесса: Издательство "Чорномор'я", 2011. — 428 с.
5. Curtis D. Klaassen. Induction of Metallothionein as an Adaptive Mechanism Affecting the Magnitude and Progression of Toxicological Injury / D. Curtis Klaassen and Jie Liu// Environmental Health Perspectives. — 1998. — № 106, Suppl. 1. — P. 297–300.
6. Збірник важливих офіційних матеріалів з санітарних і протиепідемічних питань. Видання офіційне: в 6 т. [Під загальною редакцією Головного державного санітарного лікаря України В.Ф. Марієвського]. Т. 1. Частина 2. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. — Київ, 1995. — 246 с.
7. ДсанПіН 2.2.4-171-10 "Гігієнічні вимоги до води питної, призначеної для споживання людиною".
REFERENCES
1. Obschaya toksikologiya // Pod red. B.A. Kurlyandskogo, V.A. Filova. — M. Medicina, 2002. — 608 s.
2. Foulkes Е.С. // Transport of Heavy Metals by the Kidney / Б.C. Foulkes // Toxicology Letters. — 1990. — V. 53, № 1–2. — P. 29–31.
3. Pykhteeva E.G. Metallotionein: biologicheskie funkcii. Rol' metallotioneina v transporte metallov v organizme / E.G. Pykhteeva // Aktual'nye problemy transportnoj mediciny. — № 4 (18), 2009. — S. 44–58.
4. Shafran L.M. Metalloshoneiny / L.M. Shafran, E.G. Pykhteeva, D.V. Bol'shoj / pod redakciej prof. L.M. Shafrana. — Odessa: Izdatel'stvo "Chornomor'ya", 2011. — 428 s.
5. Curtis D. Klaassen. Induction of Metallothionein as an Adaptive Mechanism Affecting the Magnitude and Progression of Toxicological Injury / D. Curtis Klaassen and Jie Liu// Environmental Health Perspectives. — 1998. — № 106, Suppl. 1. — P. 297–300.
6. Zbirnyk vazhlyvykh oficijnykh materialiv z sanitarnykh i protyepidemichnykh pytan'. Vydannya oficijne: v 6 t. [Pid zahal'noyu redakciyeyu Holovnoho derzhavnoho sanitarnoho likarya Ukrainy V.F. Mariyevs'koho]. T. 1. Chastyna 2. Mediko-biologicheskie trebovaniya i sanitarnye normy kachestva prodovol'stvennogo syr'ya i pischevykh produktov. — Kiїv, 1995. — 246 s.
7. DsanPiN 2.2.4-171-10 "Hihiyenichni vymohy do vody pytnoi, pryznachenoi dlya spozhyvannya lyudynoyu".
Надійшла до редакції 1.07.2013 p.