Вступ. При широкому застосуванні пестицидів у сільському господарстві особливого значення набуває перевірка їх токсичного впливу на тваринний та людський організми [2-7, 10, 12, 14, 15]. Одним з важливих етапів токсиколого-гігієнічної перевірки нових пестицидів є визначення їх гострої токсичності. Метою даної роботи було визначити напівлетальну дозу (ЛД50) нового пестициду "Антал" (діючі речовини: тіабендазол — 80 г/л, імазаліл — 125 г/л, тебуконазол — 60 г/л), а також нового пестициду "Нео" (діюча речовина: нікосульфурон — 750 г/кг) в поєднанні з поверхнево-активною речовиною (ПАР) "Мікс" у співвідношенні 1:5 (саме у такому співвідношенні рекомендується його застосування виробником у сільському господарстві) [8] при пероральному введенні для представника класу птахів — японського перепела (Coturnix coturnix japonica).
Матеріали і методи досліджень
Дослідження було проведено на 118 самцях і 91 самиці японського перепела (Coturnix coturnix japonica) 6-7-тижневого віку. Птахів утримували в умовах стаціонарного віварію, кожна експериментальна група знаходилася в окремій клітці, призначеній саме для вирощування птахів. Світловий режим: 16 годин — світло, 8 годин — темрява. Температура повітря у віварії підтримувалася на рівні +22°С. Вода подавалась без обмежень у спеціальних пташиних поїлках; воду замінювали 1 раз на добу. Годівлю проводили без обмежень комбікормом для перепелів марки ПК 1-22П виробництва АТ "Київ-Атлантик Україна".
Основні етапи досліджень були проведені у відповідності з методичними вказівками по гігієнічній оцінці нових пестицидів [9], правилами Американської агенції з охорони навколишнього середовища для пестицидів і токсичних субстанцій [1] та іншими рекомендаціями з токсикологічних досліджень [2, 4, 7, 11, 12, 15].
Для приблизного визначення токсичної дози вищевказаних пестицидів спочатку були проведені попередні дослідження. Для цих досліджень було взято 27 самців японських перепелів, з яких було сформовано експериментальні групи по 3 самці у кожній групі. Птахам кожної групи одноразово перорально за допомогою спеціально переобладнаного шприца вводили суміш пестициду "Нео" з ПАР "Мікс" або пестицид "Антал".
Пестицид "Антал" вводили у дозах 25, 250, 1000, 2500, 3000 мг/кг маси тіла. Перед введенням пестицид "Антал" розчинили в дистильованій воді в 400 разів (для дози 25 мг/кг маси тіла), в 40 разів (для дози 250 мг/кг маси тіла), в 10 разів (для дози 1000 мг/кг маси тіла), в 4 рази (для дози 2500 мг/кг маси тіла), в 3,33 раза (для дози 3000 мг/кг маси тіла).
Суміш пестициду "Нео" з ПАР "Мікс" давали у дозах 200, 2000, 5000 та 10000 мг/кг маси тіла. Для приготування вищезазначеної суміші 2 г пестициду "Нео" змішали з 10 мл поверхнево-активної речовини "Мікс" (тобто, у співвідношенні 1:5) та відповідною кількістю дистильованої води: для дози 200 мг/кг — 490 мл, для дози 2000 мг/кг — 40 мл, для дози 5000 мг/кг — 10 мл, для дози 10000 мг/кг — 10 мл. Дану суміш давали по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха (окрім дози 10000 мг/кг, де давали по 2 мл на кожні 100 г маси тіла птаха).
Дозу препарату розраховували індивідуально для кожного птаха, виходячи з маси його тіла. Після введення препарату за піддослідними птахами перші 2-3 години вели неперервні спостереження, а потім — періодичні через кожні 2-3 години (для перших 12 годин після введення препарату) і через кожні 12 годин протягом наступних 3-х діб. Спостерігали за наявністю чи відсутністю симптомів отруєння, часом їх появи та зникнення, а також реєстрували час загибелі (якщо смерть мала місце) кожного піддослідного птаха. Результати попередніх досліджень були використані для планування основних досліджень.
З метою остаточного визначення напівлетальної дози кожного пестициду були проведені основні дослідження. Для цього були використані 91 самець та 91 самиця японського перепела. Після отримання птахи були акліматизовані до умов віварію. Щоб врахувати можливі статеві відмінності в чутливості перепелів до пестицидів, у кожну експериментальну групу брали однакову кількість самців та самиць. З цих перепелів було сформовано такі експериментальні групи (по 7 самців і 7 самиць у кожній групі):
1. контрольна група — отримували дистильовану воду;
2. отримували препарат "НЕО"+ПАР "МІКС" у дозі 2000 мг/кг маси тіла;
3. отримували препарат "НЕО"+ПАР "МІКС" у дозі 2250 мг/кг маси тіла;
4. отримували препарат "НЕО"+ПАР "МІКС" у дозі 2500 мг/кг маси тіла;
5. отримували препарат "НЕО"+ПАР "МІКС" у дозі 3000 мг/кг маси тіла;
6. отримували препарат "НЕО"+ПАР "МІКС" у дозі 3250 мг/кг маси тіла;
7. контрольна група — отримували дистильовану воду;
8. отримували препарат "Антал" у дозі 1000 мг/кг маси тіла;
9. отримували препарат "Антал" у дозі 1100 мг/кг маси тіла;
10. отримували препарат "Антал" у дозі 1250 мг/кг маси тіла;
11. отримували препарат "Антал" у дозі 1500 мг/кг маси тіла;
12. отримували препарат "Антал" у дозі 2000 мг/кг маси тіла;
13. отримували препарат "Антал" у дозі 2500 мг/кг маси тіла.
Безпосередньо перед введенням пестициду птахів зважували. Дозу препарату розраховували індивідуально для кожного птаха, виходячи з маси його тіла.
Пестицид "Антал" перед введенням розчинили в дистильованій воді в 10 разів (для дози 1000 мг/кг маси тіла), в 9,09 раза (для дози 1100 мг/кг маси тіла), в 8 разів (для дози 1250 мг/кг маси тіла), в 6,66 раза (для дози 1500 мг/кг маси тіла), в 5 разів (для дози 2000 мг/кг маси тіла), в 4 рази (для дози 2500 мг/кг маси тіла); потім відповідну кількість розчину препарату вводили перорально одноразово за допомогою спеціально переобладнаного шприца.
Для приготування суміші пестициду "Нео" з ПАР "Мікс" змішували:
1) для дози 2000 мг/кг — 2 г пестициду "Нео" + 10 мл ПАР "Мікс" + 40 мл дистильованої води;
2) для дози 2250 мг/кг — 2 г пестициду "Нео" + 10 мл ПАР "Мікс" + 34,5 мл дистильованої води;
3) для дози 2500 мг/кг — 2 г пестициду "Нео" + 10 мл ПАР "Мікс" + 30 мл дистильованої води;
4) для дози 3000 мг/кг — 3 г пестициду "Нео" + 15 мл ПАР "Мікс" + 35 мл дистильованої води;
5) для дози 3250 мг/кг — 3 г пестициду "Нео" + 15 мл ПАР "Мікс" + 31,2 мл дистильованої води.
Дану суміш давали по 1 мл на кожні 100 г маси тіла птаха.
Контрольним групам аналогічним чином давали чисту дистильовану воду.
Після введення відповідного препарату за птахами вели неперервні спостереження перші 3 години після введення препарату, а потім — регулярні через 6, 12, 24, 36 та 48 годин після введення препарату, а в подальшому — 1 раз на добу. Спостерігали за наявністю чи відсутністю симптомів отруєння, часом їх появи та зникнення, а також — за часом загибелі (якщо смерть мала місце) кожного піддослідного птаха. Спостережний період становив 14 діб. Результати цих спостережень наведені у таблицях 1 та 2.
Напівлетальну дозу (ЛД50) кожного пестициду розраховували за методом графічного пробіт-аналізу [13, 15]. Стандартну похибку розраховували за формулою [15]:
95% довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05) підраховували за формулою [15]:
S LD50 — стандартна похибка напівлетальної дози;
DLD50 — довірчий інтервал напівлетальної дози;
t - t-критерій Стьюдента при P<0,05 і числі ступенів свободи f-1, де f — кількість тварин, використана в експерименті;
LD84 — доза, при якій гине 84 % особин, відповідає пробіту 6;
LD16 — доза, при якій гине 16 % особин, відповідає пробіту 4;
N — кількість тварин в групах, для яких пробіти знаходяться між 3,5 і 6,5 [15].
Результати досліджень та їх обговорення
Попередні дослідження. Результати попередніх досліджень показали, що легкі симптоми отруєння з’являються у піддослідних птахів при введенні пестициду "Антал" навіть у дозі 25 мг/кг маси тіла. Проте введення цього препарату в дозах 25, 250 та 1000 мг/кг маси тіла не супроводжується смертністю; при його введенні в дозі 2500 мг/кг гине 66,6 % особин; а при введенні в дозі 3000 мг/кг має місце 100 % смертності. Отже, з попередніх досліджень випливає, що напівлетальна доза (LD50) препарату "Антал" для птахів знаходиться між 1000 мг/кг маси тіла та 2500 мг/кг маси тіла.
При введенні суміші "Нео"+ПАР "Мікс" у дозі 200 мг/кг маси тіла будь-які симптоми отруєння відсутні. Перші симптоми отруєння з’являються при введенні вищевказаного препарата у дозі 2000 мг/кг і проявляються в реакції "опущене пір’я" та гіпоактивності. Один перепел у цій групі гине. Після введення препарату у дозах 5000 та 10000 мг/кг маси тіла у всіх особин "опущене пір’я", гіпоактивність, утруднене дихання, всі вони лежать, і зрештою гинуть. Таким чином, на основі попередніх досліджень можна зробити висновок, що напівлетальна доза (ЛД50) пестицида "Нео"+ПАР "Мікс" для птахів знаходиться між 2000 мг/кг маси тіла та 5000 мг/кг маси тіла.
Основні дослідження. Для точного визначення напівлетальної дози (LD50) вищезазначених пестицидів були проведені основні дослідження.
Як уже було зазначено, піддослідні птахи були до початку експерименту акліматизовані. Під час акліматизації ніхто з перепелів не загинув і в жодної особини не було помітно жодних ознак хвороб.
У перепелів контрольних груп, які отримали чисту дистильовану воду, фактів смертності та будь-яких симптомів отруєння чи аномальної поведінки не зафіксовано.
Введення пестициду "Антал". Показники смертності та основні симптоми отруєння при введенні пестициду "Антал" представлені у таблиці 1. З цієї таблиці видно, що слабко-виражені симптоми отруєння пестицидом "Антал" з’являються при пероральному введенні цього пестициду в дозі 25 мг/кг маси тіла. Основними симптомами отруєння є "опущене пір’я" і гіпоактивність (тривають від 1 до 3-5 діб). Однак ці симптоми не супроводжуються смертністю при введенні цього пестициду в дозі 1000 мг/кг маси тіла і менше; а смертність спостерігається, починаючи з дози 1100 мг/кг маси тіла. Переважна більшість птахів гине в перші 12 год. від часу введення цього пестициду. Досить характерним є сценарій загибелі птаха: зниження активності (тварина сидить, а згодом лежить), що може супроводжуватися втратою координації рухів та закиданням голови на спину, надалі починаються конвульсивні рухи, слиновиділення з рота, що завершується загибеллю особини.
Таблиця 1 Смертність та симптоми отруєння в японських перепелів після однократного введення різних доз препарату "Антал"
Визначення напівлетальної дози (ЛД50) пестициду "Антал" методом графічного пробіт-аналізу показало, що вона становить 1544 мг/кг маси тіла (рис. 1А). Стандартна похибка, визначена за формулою (1), становить:
95 %-вий довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05), підрахований за формулою (2), становить:
Таким чином, на основі отриманих результатів можна зробити висновок, що напівлетальна доза (ЛД50) пестициду "Антал" для птахів (японських перепелів, Coturnix coturnix japonica) при пероральному однократному введенні становить 1544±92 мг/кг маси тіла, а 95 %-вий довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05) — від 1364 до 1724 мг/кг маси тіла.
Введення суміші пестициду "Нео" з поверхнево-активною речовиною "Мікс" у співвідношенні 1:5. Першими симптомами отруєння перепелів при введенні пестициду "Нео"+ПАР "Мікс" у співвідношенні 1:5 є реакція "опущене пір’я" та гіпоактивність (табл. 2). Ці симптоми розпочинаються через 10-20 хв. після введення препарату і тривають до 3-5 діб. Пізніше (через 20-40 хв. від моменту введення препарату) у частини особин спостерігається утруднене дихання, тварини можуть сидіти або лежати; ці симптоми, як правило, зникають наступної доби (якщо перепел не гине). Смертність спостерігається в основному в перші 3 доби після введення препарату. У перепелів, що вижили, протягом 3-5 діб симптоми отруєння поступово слабшають і зникають (спостерігається реакція "опущене пір’я", в ряді випадків — з гіпоактивністю), слабкі симптоми отруєння у деяких перепелів залишаються до 7 діб. У подальшому (8-14 доба) симптомів отруєння та смертності не спостерігається.
Таблиця 2 Смертність та симптоми отруєння у японських перепелів після однократного введення різних доз суміші пестициду "Нео" і ПАР "Мікс" у співвідношенні 1:5.
На основі отриманих даних методом графічного пробіт-аналізу було розраховано напівлетальну дозу (ЛД50) (рис. 1Б). З цього рисунка видно, що напівлетальна доза (ЛД50) суміші пестициду "Нео" і ПАР "Мікс", яка відповідає значенню X на кривій "доза-ефект" при Y=5, становить 2812 мг/кг маси тіла. В даній дозі міститься 469 мг чистого пестициду "Нео", а нікосульфурону, який є діючою речовиною, — 352 мг.
Рис. 1. Крива "доза-ефект" для пестицидів "Антал" та "Нео" при їх введенні японським перепелам.
Стандартна похибка, визначена за формулою (1), становить:
95 %-вий довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05), підрахований за формулою (2), становить:
Таким чином, напівлетальна доза (ЛД50) пестициду "Нео"+ПАР "Мікс" (1:5) для птахів (японських перепелів, Coturnix coturnix japonica) при пероральному однократному введенні становить 2812±164 мг/кг маси тіла, а 95 %-вий довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05) — від 2490 до 3134 мг/кг маси тіла.
ЛІТЕРАТУРА
1. Guidelines United States Environmental Protection Agency: Pesticides and Toxic Substances: Avian acute oral toxicity test. —Washington, 1996.
2. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов /Е.Ю. Афанасьева, Е.Я. Борисова, О.Л. Верстакова [и др.]. — Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2008. — 1016 с.
3. Экологическая токсикология / В.С. Безель, Е.А. Бельский, Д.В. Веселкин [и др.]. – Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2001. — 135 с.
4. Токсикологічна хімія з експрес-аналізом гострих інтоксика-цій / В.С. Бондар, О.О. Маміна, С.А. Карпушина [та ін.] . — Харків: Видавництво НфаУ, 2004.— 79 с.
5.Захаренко А.В. Гербициды. — Москва: Изд-во МСХА, 2000. — 95 с.
6. Ісаєнко В.М. Основи екологічної токсикології./ В.М. Ісаєнко — Київ: НАУ, 2007.— 67 с.
7. Основы токсикологии / П.П. Кукин, Н.Л. Пономарев, К.Р. Таранцева [и др.] А.В. Захаренко. — Москва: Высшая школа, 2008.– 279 с.
8. Пестициды: Справочник / В.И. Мартыненко, В.К. Промоненков, С.С. Кукаленко [и др.]. — Москва: Агропромиздат, 1992.– 368 с.
9. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов.— Киев, 1988.—212 с.
10. Михайловська Т.М. Екологічна токсикологія/Т.М. Михайловська. – Чернівці: Рута, 2007. — 88 с.
11. Михайловська Т.М. Методи аналізу токсикологічної хімії/ Т.М. Михайловська.— Чернівці: Рута, 2007. – 88 с.
12. Токсикологическая химия / Т.В. Плетнева, Е.М. Саломатин, А.В. Сыроешкин [и др.].— Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2006.— 509 с.
13. Плохинский Н.А. Математические методы в биологии/ А.А. Плохинский.— Москва: Изд–во Московского ун–та, 1978.— 265 с.
14. Основи токсикології / Г.Г. Рощин, А.П. Строкань, А.С. Тимченко [и др.].— Київ: КНУТД, 2007.— 138 с.
15. Ступников А.А. Токсичность гербицидов и арборицидов и профилактика отравлений животных / А.А. Ступников. — Ленинград: Колос, 1975.— 240 с.
REFERENCES
1. Guidelines United States Environmental Protection Agency: Pesticides and Toxic Substances: Avian acute oral toxicity test. —Washington, 1996.
2. Toksikologicheskaya khimiya. Metabolizm i analiz toksikantov /E.Yu. Afanas'eva, E.Ya. Borisova, O.L. Verstakova [i dr.]. — Moskva: GEOTAR-Media, 2008. — 1016 s.
3. Ekologicheskaya toksikologiya / V.S. Bezel', E.A. Bel'skij, D.V. Veselkin [i dr.]. – Ekaterinburg: Izd-vo Ural'skogo un-ta, 2001. — 135 s.
4. Toksykologichna khimiya z ekspres-analizom gostrykh intoksyka-cij / V.S. Bondar, O.O. Mamina, S.A. Karpushyna [ta in.]. — Kharkiv: Vydavnyctvo NfaU, 2004.— 79 s.
5. Zakharenko A.V. Gerbicidy. — Moskva: Izd-vo MSKhA, 2000. — 95 s.
6. Isaenko V.M. Osnovy ekologichnoi toksykologii./ V.M. Isaenko — Kyiv: NAU, 2007.— 67 s.
7. Osnovy toksikologii / P.P. Kukin, N.L. Ponomarev, K.R. Taranceva [i dr.] A.V. Zakharenko. — Moskva: Vysshaya shkola, 2008.– 279 s.
8. Pesticidy: Spravochnik / V.I. Martynenko, V.K. Promonenkov, S.S. Kukalenko [i dr.]. — Moskva: Agropromizdat, 1992.– 368 s.
9. Metodicheskie ukazaniya po gigienicheskoj ocenke novykh pesticidov.— Kiev, 1988.—212 s.
10. Mykhajlovs'ka T.M. Ekologichna toksykologiya/T.M. Mykhajlovs'ka. – Chernivci: Ruta, 2007. — 88 s.
11. Mykhajlovs'ka T.M. Metody analizu toksykologichnoi khimii/ T.M. Mykhajlovs'ka.— Chernivci: Ruta, 2007. – 88 s.
12. Toksikologicheskaya khimiya / T.V. Pletneva, E.M. Salomatin, A.V. Syroeshkin [i dr.].— Moskva: GEOTAR-Media, 2006.— 509 s.
13. Plokhinskij N.A. Matematicheskie metody v biologii/ A.A. Plokhinskij.— Moskva: Izd–vo Moskovskogo un–ta, 1978.— 265 s.
14. Osnovi toksikologії / G.G. Roschin, A.P. Strokan', A.S. Timchenko [i dr.].— Kiїv: KNUTD, 2007.— 138 s.
15. Stupnikov A.A. Toksichnost' gerbicidov i arboricidov i profilaktika otravlenij zhivotnykh / A.A. Stupnikov. — Leningrad: Kolos, 1975.— 240 s.
Надійшла до редакції 24.10.2012 р.