Клименко Л.Ю., Болотов В.В., Костина Т.А.
Национальный фармацевтический университет, г. Харьков, Украина
Дериватизация дансилхлоридом (ДНС-Сl) широко используется в анализе аминокислотной последовательности белков и полипептидов. Проведение анализа можно описать следующим образом: ДНС-Сl реагирует с непротонирован-ной α-аминогруппой пептида с образованием дансильного производного пептида (ДНС-пептида). Эта реакция проводится в щелочной среде в смешанном водно-органическом растворителе.
Что касается значения рН среды, оптимального для проведения анализа, то дансилхлорид взаимодействует с непротонированной аминогруппой в щелочной среде только при рН > 9. Однако с повышением рН среды растет вероятность протекания конкурирующей реакции — гидролиза органического реагента. При рН > 9,6 константа скорости реакции гидролиза резко возрастает, и гидролиз протекает очень интенсивно, что приводит к полной деструкции реагентов реакционной смеси уже при рН = 10. Таким образом, оптимальное значение рН для реакции дериватизации составляет 9,5-9,6.
Для поддержания рН реакционной одни авторы предлагают использовать 500 мМ боратный буферный раствор с рН 9,6, другие исследователи используют 40 мМ литий-карбонатный буферный раствор с рН 9,5 или 200 мМ натрий-гидрокарбонатный буферный раствор с рН 9,5.
Все вышеизложенное касается проведения дансилирования в растворе.
Нами исследована возможность и изучены условия проведения реакции дансилирования непосредственно на хроматографических пластинах для нормальнофазной ТСХ. Для экспериментальной работы были использованы пластины Sorbfil ПТСХII-В (силикагель СТХ-1ВЭ, тип подложки — ПЭТФ, связующее — силиказоль, фракция — 8/12 мкм, толщина слоя — 100 мкм). Предварительно проводили модификацию пластин следующими способами:
• однократное элюирование в метаноле;
• однократное элюирование в метаноле, обработка водой дистиллированной и высушивание при 100°С в течение 5 минут;
• однократное элюирование в метаноле, обработка 0,1 М метанольным раствором гидроксида калия и высушивание при 100°С в течение 30 минут; "
• однократное элюирование в метаноле, обработка 500 мМ боратным буферным раствором с рН 9,6 и высушивание при 100°С в течение 30 минут.
Для пластин, модифицированных по первому и второму типу, дериватизацию проводили двумя способами: 1) в точку на линии старта вводили пробу амина (от 1 до 10 мкг) и высушивали, затем вводили 2 мкл 500 мМ боратного буферного раствора с рН 9,6 и 5 мкл раствор дансилхлорида с концентрацией 0,75 мг/мл в ацетоне; 2) в точку на линии старта вводили пробу амина (от 1 до 10 мкг) и высушивали, затем вводили 5 мкл раствор дансилхлорида с концентрацией 0,75 мг/мл в ацетоне и 2 мкл 500 мМ боратного буферного раствора с рН 9,6.
Для пластин, модифицированных по третьему и четвертому типу, дериватизацию проводили следующим способом: в точку на линии старта вводили пробу амина (от 1 до 10 мкг) и высушивали, затем вводили 5 мкл раствор дансилхлорида с концентрацией 0,75 мг/мл в ацетоне.
После проведения дериватизации пластины элюировали в системе растворителей хлороформ — метанол (9:1) в присутствии свидетелей — дансилкислоты (получали путем обработки дансилхлорида раствором калия гидроксида) и дансиламида (получали путем обработки дансилхлорида концентрированным раствором аммиака), высушивали и просматривали в УФ-свете (λ= 366 нм) — пятна дансилпроизводных изучаемых аминов светятся ярким желтым светом, дансиламида — бирюзовым, дансилкислоты — голубым, избыток дансилхлорида в УФ-свете не имеет окрашивания.
Необходимо отметить, что для пластин первого и второго типа использование второй методики не имело положительного результата, так же как и использование пластин четвертого типа. Во всех остальных случаях дериватизация прошла успешно, при этом наблюдалась значительное уменьшение времени протекания реакции — с 30-60 до 1-2 минут.