Важливим критерієм цільової дії потенційних протипухлинних засобів є незначна токсичність по відношенню до тканин з високим ступенем проліферації. Стан гермінативного епітелію сім'яників під впливом сполуки є показником ураження швидкоп-роліферуючих тканин організму поряд із кровотворними органами і слизовою оболонкою кишечнику, а отже, і показником значної частини побічних ефектів. Синтезоване як інгібітор тирозинових протеїнкіназ похідне малеіміду 1-(4-Cl-бензил)-3-Cl-4-(CF3-феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діон (МІ-1) належить до потенційних протипухлинних засобів цільової дії [1]. На культурах клітин показана здатність МІ-1 у концентраціях 10-6-10-4 моль/л пригнічувати проліферативну активність трансформованих і злоякісних клітин людини (НЕК 293, SW-620, HCT-116, MCF7 та ін.) на 80-90% [1, 2], а нормальних фібробластів та ендотеліоцитів за тих же умов — лише на 20-30% [3]. В умовах цілісного організму після місячного впливу МІ-1 проявляє низьку гепато- [4] та нефротоксичність [5], чинить незначний вплив на слизову оболонку тонкої [6] та товстої [7] кишки, підшлункову залозу [8] та сперматогенний епітелій сім'яників [9]. Крім того, встановлені антиоксидантні властивості МІ-1 за умов підвищеного вільнорадикального окислення: здатність частково знижувати негативні наслідки оксидативного стресу на печінку [4, 10], нирки [11] та сім'яники [12]. Наступним етапом дослідження нової сполуки з антипроліферативною активністю є вивчення його впливу на організм в умовах канцерогенезу.
Метою нашої роботи було дослідження морфо-функціонального стану сім'яників щурів після впливу МІ-1 за умов розвитку експериментального раку товстої кишки.
Матеріали і методи дослідження
Дослідження проведено на 60 білих щурах-самцях масою 130-150 г на початок експерименту. Експериментальний рак товстої кишки викликали підшкірними ін'єкціями 1,2-диметилгідразину (ДМГ, Sigma-Aldrich, Germany) в дозі 20 мг/кг в 0,1 мл фізіологічного розчину один раз на тиждень протягом 20 тижнів [13]. Така модель була застосована з урахуванням того, що МІ-1 виявляв найбільший цитостатичний ефект на лініях клітин раку товстого кишечнику — SW-620, HCT-116 [1]. ДМГ є канцерогеном, що викликає пухлини переважно у товстому кишечнику та інших органах залежно від терміну введення, дози та виду експериментальних тварин [14]. Контролем для групи тварин з введенням ДМГ були щури, яким щотижня підшкірно вводили 0,1 мл фізіологічного розчину (контроль — фіз. розчин). МІ-1 в дозах 0,027 мг/кг та 2,7 мг/кг (що відповідає концентрації в крові 10-6 та 10-4 моль/л) вводили в 0,1 мл соняшникової олії щоденно інтрагастрально, контролем були щури із щоденним введенням 0,1 мл соняшникової олії (контроль олія). Інші дві групи щурів отримували одночасно ДМГ та МІ-1 в обох дозах за схемою, вказаною вище, контролем для них були щури з щотижневим введенням фізіологічного розчину та щоденним введенням олії (контроль — олія+фіз. розчин). Тварин декапітували після ефірного наркозу. В товстому кишечнику щурів цього експерименту було визначено кількість, розмір, локалізацію пухлин та проведено їх морфологічну класифікацію [13].
Для морфологічного дослідження лівий сім'яник щурів фіксували в рідині Буену, заливали у парафін. Парафінові зрізи товщиною 5-7 мкм забарвлювали гематоксиліном Б'ємера з дофарбуванням еозин-оранжем. Морфометричні дослідження проводили за допомогою світлового мікроскопу Olympus BX-41 та програми Image J. Стан сім'яників оцінювали, базуючись на мікроскопічному аналізі препаратів та морфометричних вимірах. У підкапсулярній зоні вимірювали діаметр cім'яних канальців і товщину сперматогенного епітелію в них, а також площу ядер клітин Лейдіга. Обчислювали індекс сперматогенезу, а також клітинний індекс Сертолі для сперматогоній, підраховуючи кількості сперматогоній і клітин Сертолі в одних і тих же сім'яних канальцях [15]. Статистичну обробку морфометричних даних проводили з використанням програмного пакету аналізу даних Statistica версії 4.3 для операційної системи Windows. Визначення достовірності розходжень між контрольними та експериментальними групами проводили з використанням критерію Ст'юдента для показників з нормальним розподілом та з використанням непараметричного критерію Манна-Уітні для показників з ненормальним розподілом. Результати представляли у вигляді M±m та M±s, де М — середнє арифметичне значення ознаки у виборці, m — стандартна похибка середнього, s — стандартне відхилення для кожної групи. Достовірними вважались зміни при Р<0,05.
Результати досліджень та їх обговорення
Пухлини у товстому кишечнику були виявлені в усіх тварин, які отримували ДМГ та ДМГ сумісно з МІ-1 [13]. Кількість і розмір пухлин у груп тварин, які отримували ДМГ разом з МІ-1, були менші, ніж у таких, яким вводили лише ДМГ. Відрізнялась також морфологія і локалізація пухлин: у груп щурів з введенням МІ-1 переважали аденоми, що локалізувались в основному в дистальному і проксимальному відділах товстого кишечнику, а у щурів групи з ДМГ більшість пухлин належали до аденокарцином і знаходились у дистальному відділі та в прямій кишці [13].
Рис. 1. Мікрофотографія зрізу сім'яників щурів: контрольної групи-контроль-олія (а), при дії МІ-1 в дозі 2,7 мг/кг (б), при дії ДМГ в дозі 20 мг/кг (в) та при дії ДМГ, 20 мг/кг сумісно з МІ-1 в дозі 2,7 мг/кг (г) після 20 тижнів впливу. Гематоксилін-еозин-оранж. Зб. 150
Нами встановлено, що введення МІ-1 в обох дозах протягом 20 тижнів не викликає суттєвих морфологічних змін у сім'яниках щурів (рис. 1, а, б). Однак серед основної маси незмінених сім'яних канальців на поперечних зрізах сім'яників зустрічаються поодинокі канальці із порушенням цілісності сперматогенного епітелію, зменшенням його товщини, дезорганізацією клітин епітелію та зниженою кількістю сперматозоїдів у просвітах. Проте морфометричний аналіз зрізів сім'яників щурів піддослідних груп не виявив вірогідних змін у діаметрі канальців і товщині сперматогенного епітелію та площі ядер клітин Лейдіга під впливом МІ-1 (табл. 1). Розрахунок індексу сперматогенезу в обох групах виявив лише тенденцію до його зниження (табл. 2). Індекс Сертолі вірогідно не відрізнявся від контролю. Судини мікроциркуляторного русла помірно кровонаповненні. Стромальний компонент сім'яників обох груп у стані незначного набряку.
Таблиця 1
Вплив МІ-1 на морфометричні показники сім'яників щурів за умов розвитку ДМГ-індукованого раку товстої кишки (M±m)
Таблиця 2
Вплив МІ-1 на показники сперматогенезу сім'яників щурів за умов розвитку ДМГ-індукованого раку товстої кишки (M±m)
За умов ДМГ-індукованого раку товстої кишки у сім'яниках щурів не виявлено значних деструктивних змін. Більшість канальців зберігає свою форму та структуру (рис.1, в), в них не відмічено значних відмінностей від сім'яників щурів групи контроль фіз. розчин. Такі показники структурно-функціонального стану сім'яників щурів цієї групи як індекс сперматогенезу, діаметр сім'яних канальців та площа ядер клітин Лейдіга істотно не змінюються (табл. 1, 2 ). Проте за умов ДМГ-індукованого раку товстої кишки у сім'яниках щурів-пухлиноносіїв відбувається пригнічення процесів сперматогенезу, про що свідчить зменшення кількості сперматогоній (клітинного індексу Сертолі) у сім'яних канальцях на 9% (табл. 2) та витончення сперматогенного епітелію на 18% (табл. 1). У деяких канальцях відмічено наявність дрібних сперматогоній. У судинах невеликого діаметру місцями спостерігається стаз крові та тромбоз. У сполучнотканинній стромі відмічається набряк.
Одночасне застосування ДМГ та МІ-1 в обох дозах не викликає значних змін у структурі сім'яників щурів (рис. 1, г). Так само як і в попередній групі, індекс сперматогенезу, діаметр сім'яних канальців та площа ядер клітин Лейдіга залишаються без змін порівняно з відповідним контролем (табл. 1, 2). Крім того, при дії МІ-1 в обох дозах висота сперматогенного епітелію не відрізняється вірогідно від контролю (олія + фіз. розчин) (табл. 1). Тобто застосування МІ-1 зменшує пошкодження сперматогенного епітелію за умов ДМГ-індукованого канцерогенезу товстої кишки. Однак зменшення клітинного індексу Сертолі залишається на рівні індивідуального впливу ДМГ — близько 9% при дії МІ-1 в обох дозах (в дозі 0,027 мг/кг — на 8,5%, в дозі 2,7 мг/кг — на 9,5%) (табл. 2).
Таким чином, пероральне введення МІ-1 щурам протягом 20 тижнів у досліджених дозах не викликає морфо-функціональних змін у сім'яниках щурів, що були виявлені у попередніх дослідженнях при менших термінах впливу МІ-1. Так, застосування МІ-1 протягом місяця та протягом 10 днів викликало пригнічення проліферативної активності сперматогенних клітин (зменшення індексу Сертолі) приблизно на 30% [9, 12]. Цікаво також, що при дослідженні впливу МІ-1 протягом місяця на слизову оболонку тонкої та товстої кишок пригнічення процесів поділу клітин (зменшення мітотичного індексу) також відбувалось на 30-35% [6, 7]. Ці дані співпадають з результатами досліджень на культурах нормальних клітин, в яких МІ-1 пригнічував проліферативну активність фібробластів та ендотеліоцитів на 20-30% [3]. В наших дослідженнях при тривалій дії МІ-1 не відбувається пригнічення процесів сперматогенезу у сім'яних канальцях щурів, що очевидно пов'язано із адаптаційними процесами, які включаються при тривалій дії агента.
За умов ДМГ-індукованого раку товстої кишки у сім'яниках щурів-пухлиноносіїв відбувається пригнічення процесів сперматогенезу. МІ-1 справляє деяку протективну дію на сім'яники щурів за умов експериментального канцерогенезу, сприяючи відновленню висоти сперматогенного епітелію, однак зменшення кількості сперматогоній у сім'яних канальцях залишається на рівні впливу ДМГ.
Отже, застосування МІ-1 зменшує пошкодження сперматогенного епітелію за умов ДМГ-індукованого канцерогенезу товстої кишки, що вказує на перспективність досліджень МІ-1 з метою створення протипухлинних засобів.
ЛІТЕРАТУРА
1. Дубініна Г.Г. Антипроліферативна дія нових похідних 1-(4-R-бензил)-3-R1-4-(R2-феніламіно)-1H-пірол-2,5-діону / Г.Г. Дубініна, С.М. Головач, В.О. Козловський [та ін.] // Журнал органічної та фармацевтичної хімії. — 2007. — Т.5, №1. — С. 39-49.
2. Островська Г.В. Цитостатична дія похідних малеіміду на клітинах лінії НЕК293 / Г.В. Островська, К.О. Ніжерадзе, Г. Г. Дубініна, В.К. Рибальченко // Матер. 2-го з'їзду Українського товариства клітинної біології. — Київ, 23-26 жовтня 2007. —С. 126.
3. Yablonska S. Antiproliferative effects and influence on liver condition after per os administration of novel cytostat-ic maleimide derivate / S. Yablonska, O. Lynchak, O. Filinska [et al.] // The FEBS Journal "Life's molecular interactions: 34th FEBS Congress". — 2009. —V. 276. — P. 352.
4. Яблонська С.В. Оцінка гепатотоксичності нового похідного малеіміду з цитостатичною активністю і його вплив на перекисне окислення та антиоксидантну систему печінки / С.В. Яблонська, О.М. Філінська, Г.В. Островська, В.К. Рибальченко // Укр. біохім. журн. — 2009. — Т.81, №3. — С. 83-92.
5. Харчук І.В. Особливості морфо-функціонального стану нирок під впливом різних доз та тривалості дії потенційного цитостатика похідного малеіміду 1-(4-Cl-бензил)-3-Cl-4-(CF3-феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діону /| І.В. Харчук, Н.О. Карпезо, Г.В. Островська [та ін.] // Доп. НАН України. — 2009, № 10. — С. 185-188.
6. Линчак О.В. Стан слизової оболонки тонкої кишки щурів після впливу похідного малеіміду / О.В. Линчак, І.В. Харчук, Н.О. Карпезо [та ін.] // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Збір. наук. праць. — Київ-Луганськ-Харків. — 2009. — Вип. 8 (95). — С. 52-58.
7. Линчак О.В. Вплив похідного малеіміду з цитостатичними властивостями на стан слизової оболонки товстої кишки щурів / О.В. Линчак, І.В. Харчук, Н.О. Карпезо [та ін.] // Вісник морфології. — 2010. — Т.16, № 1. — С. 10-13.
8. Харчук І.В. Морфологічні зміни у підшлунковій залозі щурів під впливом 1-(4-Cl-бензил)-3-хлор-4-(CF3-феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діону / І.В. Харчук, О.В. Линчак, Н.О. Кар-пезо [та ін.] // Совр. пробл. токсикол. — 2008. —№4. — С. 16-19.
9. Харчук І.В. Морфо-функціональні зміни в сім'яниках щурів під впливом нового антинеопластичного препарату, похідного малеіміду / І.В. Харчук, Н.О. Карпезо, Г.В.Островська [та ін.] // Совр. пробл. токсикол. — 2008, №1. — С.61-65.
10. Линчак О.В. Вплив похідного малеіміду на стан печінки щурів при оксидативному стресі, спричиненому введенням хлориду кобальту / О.В. Линчак, В.К. Рибальченко, С.В. Яблонська [та ін.] // Доп. НАН України. — 2010. №2. С. 160-163.
11. Харчук І.В. Зниження нефротоксичного впливу оксидативного стресу похідним малеіміду 1-(4-Cl-бензил)-3-Cl-4-(CF3-феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діоном / І.В. Харчук, Н.О. Карпезо, О.М. Філінська [та ін.] // Урологія. — 2009. №1. — С. 27-31.
12. Пристопюк В.С. Стан сім'яників щурів під впливом нового похідного малеіміду з антипроліферативною активністю за умов оксидативного стресу / В.С. Пристопюк, І.В. Харчук, Г.В. Островська // Збірник наукових праць "Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології". Київ-Луганськ-Харків. —2009. — Випуск 9 (96). — С. 36-43.
13. Lynchak O. Effects of new maleimide derivate on the 1,2-dimethylhydrazine-induced colon carcinogenesis in rats / O. Lynchak, G. Ostrovska, V. Rybalchenko // Gut "GASTRO 2009 UEGW/WCOG, London". — 2009. — V. 58 (Suppl. II). — P. A334.
14. Perse M. The dimethylhydrazine induced colorectal tumours in rat — experimental colorectal carcinogenesis / M. Perse, A. Сerar // Radiol. Oncol. —2005. — V. 39, №1. — 61-70.
15. Ухов Ю.И. Морфометрические методы в оценке функционального состояния семенников / Ю.И. Ухов, А.Ф. Астраханцев // Арх. анат., гистол. и эмбриол. 1983. №3. — С. 66- 72.
REFERENCES
1. Dubinina H.H. Antyproliferatyvna diya novykh pokhidnykh 1-(4-R-benzyl)-3-R1-4-(R2-fenilamino)-1H-pirol-2,5-dionu / H.H. Dubinina, S.M. Holovach, V.O. Kozlovs'kyj [ta in.] // Zhurnal orhanichnoi ta farmacevtychnoi khimii. — 2007. — T.5, №1. — S. 39-49.
2. Ostrovs'ka H.V. Cytostatychna diya pokhidnykh maleimidu na klitynakh linii NEK293 / H.V. Ostrovs'ka, K.O. Nizheradze, H. H. Dubinina, V.K. Rybal'chenko // Mater. 2-ho z'izdu Ukrains'koho tovarystva klitynnoi biolohii. — Kyiv, 23-26 zhovtnya 2007. —S. 126.
3. Yablonska S. Antiproliferative effects and influence on liver condition after per os administration of novel cytostat-ic maleimide derivate / S. Yablonska, O. Lynchak, O. Filinska [et al.] // The FEBS Journal "Life's molecular interactions: 34th FEBS Congress". — 2009. —V. 276. — P. 352.
4. Yablons'ka S.V. Ocinka hepatotoksychnosti novoho pokhidnoho maleimidu z cytostatychnoyu aktyvnistyu i joho vplyv na perekysne okyslennya ta antyoksydantnu systemu pechinky / S.V. Yablons'ka, O.M. Filins'ka, H.V. Ostrovs'ka, V.K. Rybal'chenko // Ukr. biokhim. zhurn. — 2009. — T.81, №3. — S. 83-92.
5. Kharchuk I.V. Osoblyvosti morfo-funkcional'noho stanu nyrok pid vplyvom riznykh doz ta tryvalosti dii potencijnoho cytostatyka pokhidnoho maleimidu 1-(4-Cl-benzyl)-3-Cl-4-(CF3-fenilamino)-1N-pirol-2,5-dionu /| I.V. Kharchuk, N.O. Karpezo, H.V. Ostrovs'ka [ta in.] // Dop. NAN Ukrainy. — 2009, № 10. — S. 185-188.
6. Lynchak O.V. Stan slyzovoi obolonky tonkoi kyshky schuriv pislya vplyvu pokhidnoho maleimidu / O.V. Lynchak, I.V. Kharchuk, N.O. Karpezo [ta in.] // Problemy ekolohichnoi ta medychnoi henetyky i klinichnoi imunolohii. Zbir. nauk. prac'. — Kyiv-Luhans'k-Kharkiv. — 2009. — Vyp. 8 (95). — S. 52-58.
7. Lynchak O.V. Vplyv pokhidnoho maleimidu z cytostatychnymy vlastyvostyamy na stan slyzovoi obolonky tovstoi kyshky schuriv / O.V. Lynchak, I.V. Kharchuk, N.O. Karpezo [ta in.] // Visnyk morfolohii. — 2010. — T.16, № 1. — S. 10-13.
8. Kharchuk I.V. Morfolohichni zminy u pidshlunkovij zalozi schuriv pid vplyvom 1-(4-Cl-benzyl)-3-khlor-4-(CF3-fenilamino)-1N-pirol-2,5-dionu / I.V. Kharchuk, O.V. Lynchak, N.O. Kar-pezo [ta in.] // Sovr. probl. toksykol. — 2008. —№4. — S. 16-19.
9. Kharchuk I.V. Morfo-funkcional'ni zminy v sim'yanykakh schuriv pid vplyvom novoho antyneoplastychnoho preparatu, pokhidnoho maleimidu / I.V. Kharchuk, N.O. Karpezo, H.V.Ostrovs'ka [ta in.] // Sovr. probl. toksykol. — 2008, №1. — S.61-65.
10. Lynchak O.V. Vplyv pokhidnoho maleimidu na stan pechinky schuriv pry oksydatyvnomu stresi, sprychynenomu vvedennyam khlorydu kobal'tu / O.V. Lynchak, V.K. Rybal'chenko, S.V. Yablons'ka [ta in.] // Dop. NAN Ukrainy. — 2010. №2. S. 160-163.
11. Kharchuk I.V. Znyzhennya nefrotoksychnoho vplyvu oksydatyvnoho stresu pokhidnym maleimidu 1-(4-Cl-benzyl)-3-Cl-4-(CF3-fenilamino)-1N-pirol-2,5-dionom / I.V. Kharchuk, N.O. Karpezo, O.M. Filins'ka [ta in.] // Urolohiya. — 2009. №1. — S. 27-31.
12. Prystopyuk V.S. Stan sim'yanykiv schuriv pid vplyvom novoho pokhidnoho maleimidu z antyproliferatyvnoyu aktyvnistyu za umov oksydatyvnoho stresu / V.S. Prystopyuk, I.V. Kharchuk, H.V. Ostrovs'ka // Zbirnyk naukovykh prac' "Problemy ekolohichnoi ta medychnoi henetyky i klinichnoi imunolohii". Kyiv-Luhans'k-Kharkiv. —2009. — Vypusk 9 (96). — S. 36-43.
13. Lynchak O. Effects of new maleimide derivate on the 1,2-dimethylhydrazine-induced colon carcinogenesis in rats / O. Lynchak, G. Ostrovska, V. Rybalchenko // Gut "GASTRO 2009 UEGW/WCOG, London". — 2009. — V. 58 (Suppl. II). — P. A334.
14. Perse M. The dimethylhydrazine induced colorectal tumours in rat — experimental colorectal carcinogenesis / M. Perse, A. Сerar // Radiol. Oncol. —2005. — V. 39, №1. — 61-70.
15. Ukhov Yu.I. Morfometricheskie metody v ocenke funkcional'nogo sostoyaniya semennikov / Yu.I. Ukhov, A.F. Astrakhancev // Arkh. anat., gistol. i embriol. 1983. №3. — S. 66-72.
Надійшла до редакції 29.06.2010 р.