Б.П. Кузьмінов1, професор, доктор мед. наук, Д.Д. Остапів2 старший наук, співробітник, доктор сільгосп.наук, Т.С. Зазуляк1, старший наук, співробітник, кандидат біол. наук, В.А. Туркіна1, старший наук, співробітник, кандидат біол. наук, Т.А. Микітчак3, старший наук, співробітник, кандидат біол. наук, O.I. Грушка1
1Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького
2Інститут біології тварин НААН
3Інститут екології Карпат НАН України
SUMMARY. Purpose. Evaluation of the toxicity of drug L-lysine aescinat on cladocerans Daphnia magna Straus and bull semen.
Methods. The criterion of toxicity for cladocerans Daphnia magna Straus was the death of 50% or more test organisms within a specified period of time (over 1 hour, 6 hrs., 24 hrs., 48 hrs., 72 hrs. and 96 hrs. of the experiment). To compare the toxicity of different concentrations of L-lysine aescinat (0,06 mg/dm3, 0,12mg/dm3, 0,2 mg/dm3, 7,2mg/dm3,15mg/dm3,30 mg/dm3) the average lethal concentration for a certain duration has used. All of the experiments used 180 organisms D. magna under 24 hours and 30 organisms in the control volume. To assess the toxicity L-lysine aescinat on bull spermatozoa were used the freshly prepared ejaculates with the following physiological characteristics: volume 4,5 cm3, sperm concentration 0,7–0,9х10 cells/cm9, the number of live gametes 70–85%. Sperm samples were divided into control sample which was diluted with phosphate-buffered saline and research samples with the addition of L-lysine aescinat in 1/250 LD50 (3,36 mg) and LD50 (815 mg) doses to phosphate-buffered saline. Survival of spermatozoa (hrs.) until termination of rectilinear translational motion in semen preserved at 2–50C, respiratory activity (ex tempore) and recovery activities were determined.
Results. It was found that toxicity of L-lysine aescinat causes the death of 50% of cladocerans Daphnia magna Straus, which is manifested within 3,7–18,7 mg/dm, depending on time of action and concentration. L-lysine aescinat in doses 1/250 LD50 and LD50 affects bull semen, that is characterized by low intensity of oxidation processes, reduced functioning of the respiratory chain of mitochondria and the resynthesis ofATP, which leads to loss of mobility and reduce the duration of survival.
Conclusions. The concentration of L-lysine aescinat 15 mg/dm3 is slightly toxic and belongs to the 2nd grade of toxicity. The concentration of L-lysine aescinat 30 mg/dm3 is moderately toxic, 3nd grade of toxicity.
Keywords: L-lysine aescinat, cladocerans Daphnia magna Straus, bull semen, toxicity.
"L-лізину есцинат” (“L-lysine aescinat”, код АТС С05 СХ 03), новий вітчизняний лікарський препарат, який випускається корпорацією “Артеріум” на потужностях AT “Галичфарм” (м. Львів) [1]. Активнодіючою речовиною препарату є водорозчинна сіль есцину (суміші тритерпенових сапонінових глікозидів із плодів каштану кінського) та амінокислоти лізину [2]. L-лізину есцинат володіє протизапальною, протинабряковою та знеболюючою дією. Препарат призначають при посттравматичних, інтра- і післяопераційних набряках будь-якої локалізації, струсах мозку та при порушенні венозного кровообігу [3, 4, 5]. Промислове виробництво L-лізину есцинату обумовило проведення токсикологічної оцінки та обґрунтування допустимого рівня вмісту речовини в повітрі робочої зони [6].
За правилами нового європейського законодавства, яке набуло чинності з 2007 року, до переліку обов’язкових методів оцінки потенційної небезпечності хімічних речовин для здоров’я людини і довкілля повинні бути включені методи оцінки токсичності на альтернативних тест-об’єкгах [7].
Метою роботи була токсикологічна оцінка L-лізину есцинату на альтернативних тест-об’єктах — гіллястовусих рачках Daphnia magna Straus та сперміях бугаїв.
Матеріали та методи дослідження. L-лізин есцинат — порошок білого або злегка кремового кольору. Емпірична формула С60Н108К2О27.
Структурна формула:
Молекулярна маса препарату дорівнює 1288. Температура плавлення 227–233°С. Добре розчинний у воді та в оптовій кислоті, малорозчинний у метанолі та практично нерозчинний у 96 % етанолі та ефірах. Середньо-смертельна доза (ЛД50) L-лізину есцинату при пероральному введенні для білих щурів-самців становить 815 мг/кг [6].
Оцінку токсичності L-лізину есцинату для гіллястовусих рачків Daphnia magna Straus (D. magna) проводили у відповідності з КНД 211.14.054-97 [8]. Критерієм токсичності препарату була загибель 50% і більше піддослідних тварин упродовж визначеного часу (через 1 год., 6 год., 24 год., 48 год., 72 год., та 96 год. проведення експерименту). Для порівняння токсичності різних концентрацій L-лізину есцинату (0,06 мг/дм3, 0,12 мг/дм3, 0,2 мг/дм3, 7,2 мг/дм3, 15 мг/дм3, 30 мг/дм3) використовували середню летальну концентрацію (JIK50) за певний термін дії. Для кожної концентрації проведено по три паралельні досліди на виживання.
Перед проведенням дослідів визначали придатність культури дафній до біотестування за допомогою еталонної токсичної речовини — двохромовокислого калію (K2Cr207). JIK50 у цьому випадку становила 1,1 мг/дм3. Експериментально встановлений діапазон реагування тест-об’єкту D. magna коливається у межах 0,9–1,5 мг/дм3. Тобто культура була придатною для проведення біотестування. Всього у дослідах використано 180 особин D. magna віком до 24 год. та 30 особин у контрольному об’ємі. Дафній розсаджували по 10 особин у ємності зі 100 см3 води.
Для оцінки токсичності L-лізину есцинату на сперміях бугаїв використовували свіжоотримані еякуляти таких фізіологічних характеристик: об’єм 4–5 см3, концентрація сперміїв 0,7–0,9х109 клітин/см3, кількість живих статевих клітин 70–85 %. Проби сперми ділили на контрольну розріджену фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) складу: NaCl — 0,8 г, КС1 — 0,02 г, Na2HPО4 — 0,11 г, КН2РО4 — 0,02 г, MgCl2 — 0,01 г, Н2О до 100 см3) та дослідні з додаванням у ФСБ L-лізину есцинату у дозах 1/250 ЛД50 (3,36 мг) та ЛД50 (815 мг). Визначали: виживання сперміїв (год.) до припинення прямолінійного поступального руху в збереженій при температурі 2–5 °С спермі, дихальну активність (ех tempore) — полярографічно (нг-атом 0/0,1 см3 сперми (С)Чхв) у термостатованій комірці (температура 38,5 °С) об’ємом 1,0 см3 з автоматичною реєстрацією перебігу процесу самопишучим потенціометром; відновну активність — потенціометрично (mV/0,1 см3 СЧхв) з використанням системи відкритих мікроелектродів, які вставляли в термостатовану полярографічну комірку [8]. Статистичний аналіз отриманого матеріалу проведено за М.О. Плохінським [9].
Результати досліджень та їх обговорення.
Динаміка загибелі D. magna упродовж біотестування L-лізину есцинату наведена у табл. 1.
Таблиця 1.
Динаміка загибелі D. magna упродовж біотестувашія L-лізину есцинату
Смертність обраховано за співвідношенням загиблих особин у досліді до загиблих особин у контролі. Встановлено, що в порівнянні з контролем, порогова смертність особин дафній проявляється в концентраціях від 0,12 до 0,2 мг/дм3. Проте у цьому випадку смертність особин є невисокою (7% за 96 год.) і не достовірно відрізняється від рівня смертності у контролі (0% за 96 год.), вказуючи на низьку токсичну дію. Достовірна різниця між смертністю особин в експерименті (33%) й контролі (0%) відзначена після 24 год. дії препарату в концентрації 30 мг/дм3 (табл. 2).
Таблиця 2. Смертність особин D. magna відносно контролю (%)
За часом проведення експерименту та смертністю 50% особин і більше встановлено, що концентрація L-лізину есцинату 15 мг/дм3 є слаботоксичною й належить до другого класу токсичності; концентрація 30 мг/дм3 — помірно токсична, 3 клас токсичності. Менші концентрації не є токсичними чи мають статистично непідтверджену опосередковану дію на життєвість дафній.
Показники смертності було переведено у статистичні пробітні величини (пробіти), а концентрації речовини — у їхній десятковий логарифм, при цьому використовувалися показники смертності, більші за нуль і менші за 100%. За пробітами та десятковим логарифмом концентрацій побудовано графіки (рис. 1–3) для розрахунку JIK50 за антилогарифмом концентрації до пробіти зі значенням 5. Також визначено середнє квадратичне відхилення (а) ЛК50 за трьома повторностями кожного досліду.
Рис. 1. Графік для розрахунку летальної концентрації L-лізину есцинату — 48 год. (пробіті 5 відповідає lg10 1,22); ЛК50 за антилогарифмом дорівнює 16,6 мг/дм3
<./p>
Рис. 2. Графік для розрахунку летальної концентрації L-лізину есцинату — 72 год. (пробіті 5 відповідає lg10 1,07); ЛК50 за антилогарифмом дорівнює 11,8 мг/дм3
Рис. 3. Графік для розрахунку летальної концентрації — 96 год. (пробіті 5 відповідає lg10 0,92); ЛК50 за антилогарифмом дорівнює 8,3 мг/дм3
Виявлено, що ЛК50 48 год. становить 16,6±2,1 мг/дм3, JIK50 72 год. — 11,8±0,8 мг/дм3, ЛК50 96 год. — 8,3±4,6 мг/дм3. З урахуванням відхилення середнього квадратичного (а), токсичність препарату, яка призводить до смертності 50% тест-об’єктів, проявляється у межах 3,7–18,7 мг/дм3 і залежно від часу дії та концентрації.
Таким чином, встановлено, що L-лізину есцинат впливає на життєздатність особин D. magna прямопропорційно до збільшення його концентрацій та часу дії на ювенільні особини (рис. 4), тобто за умови тривалої дії препарату і більшої його концентрації, зростає відсоток смертності тест-об’єктів.
Рис. 4. Залежність ЛК50 L-лізину есцинату від часу дії речовини
L-лізину есцинат з подібним ефектом викликає негативні зміни у функціонуванні різних особин дафній, оскільки найбільша різниця між кількістю живих і загиблих дафній у паралельних дослідах з однаковими концентраціями сягала лише трьох особин. Тобто при тривалій дії препарату смертність особин істотніше відрізняється у ємностях з однаковими концентраціями, ніж за його короткотривалої порогової дії.
Результати проведеного експерименту є статистично достовірними, оскільки в контролі не загинула жодна особина, а смертність в експериментальних ємностях перевищила 50%.
Виживання сперміїв у спермі за дії L-лізину есцинату було понижене. При цьому, препарат в дозі 1/250 ЛД50 на 5,6 % знижував виживання сперміїв, а на рівні ЛД50 L-лізину есцинату зниження досягало 16,7%, порівняно з контролем (табл. 3). Вплив застосованих доз L-лізину есцинату на виживання сперміїв був слабкий за силою (h2= 0,064).
Більшими змінами характеризувалися показники дихальної та відновної активностей сперми за впливу препарату. Так, інтенсивність споживання кисню спермою за додавання L-лізину есцинату знижувалася на 40,6% за дози 1/250 ЛД50 і на 75,7% за дози ЛД50, в порівнянні з контролем. Гальмування дихальної активності супроводжувалося зменшенням транспорту протонів і електронів зі сперміїв в позаклітинне середовище, що проявлялось зниженням відновної активності за дози 1/250 ЛД50 L-лізину есцинату на 86,0 % і за ЛД50 — на 76,0 % (р < 0,05). Вплив наростаючих доз L-лізину есцинату на дихальну і відновну активність сперми був відповідно середнім за силою (h2=0,427) та сильним (h2=0,709).
Таблиця 3.
Виживання сперміїв та інтенсивність окисних процесів у спермі бугаїв за дії L-лізину есінат, п=3; М±m
Висновки
1. Токсичність L-лізину есцинату, яка призводить до смертності 50% гіллястовусих рачків Daphnia magna Straus, проявляється у межах 3,7–18,7 мг/дм2, у залежності від часу дії та концентрації. Концентрація L-лізину есцинату 15 мг/дм3 є слаботоксичною й належить до другого класу токсичності. Концентрація L-лізину есцинату 30 мг/дм3 — помірно токсична, З клас токсичності.
2. L-лізину есцинат в дозах 1/250 ЛД50 та ЛД50 чинить вплив на спермії бугаїв, який характеризується пониженою інтенсивністю окисних процесів, ймовірно, зниженим функціонуванням ланцюга дихання мітохондрій і ресинтезом АТФ, що зумовлює втрату рухливості та зменшення тривалості виживання.
ЛІТЕРАТУРА
1. Шовковий А.В. Розробка методів аналізу нових біологічно активних сполук у ряду похідних амінокислот для стандартизації лікарських засобів на їх основі: автореф. дис. на здобуття наук.ступеня канд. фарм. наук: спец.15.00.03 “Стандартизація та організація виробництва лікарських засобів” / А.В.Шовковий. — Харків, 1999. — 28 с.
2. Куцик Р.В. Каштан конський (Aesculus hippocastanum L.) / Р.В. Куцик, Б.М. Зузук, В.В. Дьячок // Провізор. — 2002. — №5. — С. 36–40.
3. Поворознюк В.В. Использование L-лизина эсцината в реабилитации больных с остеохондрозом пояснично-крестцового отдела позвоночника / В.В. Поворознюк, О.Б. Шеремет // Вісник ортопедії, травматології та протезування. — 2003. — №3. — С. 25–29.
4. Спасиченко П.В. Лечение больных с тяжелой черепно-мозговой травмой с применением L-лизина эсцината / П.В. Спасиченко // Український нейрохірургічний журнал. — 2003. — №4 (24). — С. 33–41.
5. Сапон НА. Применение препарата L-лизина эсцинат в нейрохирургии, неврологии, травматологии и ортопедии / Н.А. Сапон, П.В.Спасиченко // Новости медицины и фармации. — 2004. — № 10–11(150–151). — С. 3–5.
6. Кузшінов Б.П. Обгрунтування орієнтовно безпечного рівня впливу L-лізину есцинату у повітрі робочої зони / Б.П. Кузьмінов, О.І. Грушка, Т.С. Зазуляк // Вестник гигиены и эпидемиологии. — 2009. — Том 13. — №1. — С. 143–146.
7. Профілактична токсикологія та медична екологія. Вибрані лекції для науковців, лікарів та студентів за загальною редакцією академіка НАМИ України І.М. Трахтенберга. К.: ВД “АВІЦЕНА”, 2011. — 320 с.
8. Плохинский Н.А. Биометрия 2-е изд. / Н.А. Плохинский. — М.: Изд-во МГУ, 1970. — 367 с.
9. Штольц К.Ф. Амперометрическое определение ферроцианада в присутствии субклеточных структур / К.Ф. Штольц, И.М. Мосолова, JI.A. Дронова // Биохимические методы. — М.: Наука, 1980. — С. 147–150.
REFERENCES
1. Shovkovyj A.V. Rozrobka metodiv analizu novykh biolohichno aktyvnykh spoluk u ryadu pokhidnykh aminokyslot dlya standartyzacii likars'kykh zasobiv na ikh osnovi: avtoref. dys. na zdobuttya nauk.stupenya kand. farm. nauk: spec.15.00.03 “Standartyzaciya ta orhanizaciya vyrobnyctva likars'kykh zasobiv” / A.V.Shovkovyj. — Kharkiv, 1999. — 28 s.
2. Kucyk R.V. Kashtan kons'kyj (Aesculus hippocastanum L.) / R.V. Kucyk, B.M. Zuzuk, V.V. D'yachok // Provizor. — 2002. — №5. — S. 36–40.
3. Povoroznyuk V.V. Ispol'zovanie L-lizina escinata v reabilitacii bol'nykh s osteokhondrozom poyasnichno-krestcovogo otdela pozvonochnika / V.V. Povoroznyuk, O.B. Sheremet // Visnyk ortopedii, travmatolohii ta protezuvannya. — 2003. — №3. — S. 25–29.
4. Spasichenko P.V. Lechenie bol'nykh s tyazheloj cherepno-mozgovoj travmoj s primeneniem L-lizina escinata / P.V. Spasichenko // Ukrains'kyj nejrokhirurhichnyj zhurnal. — 2003. — №4 (24). — S. 33–41.
5. Sapon NA. Primenenie preparata L-lizina escinat v nejrokhirurgii, nevrologii, travmatologii i ortopedii / N.A. Sapon, P.V.Spasichenko // Novosti mediciny i farmacii. — 2004. — № 10–11(150–151). — S. 3–5.
6. Kuzshinov B.P. Obhruntuvannya oriyentovno bezpechnoho rivnya vplyvu L-lizynu escynatu u povitri robochoi zony / B.P. Kuz'minov, O.I. Hrushka, T.S. Zazulyak // Vestnik gigieny i epidemiologii. — 2009. — Tom 13. — №1. — S. 143–146.
7. Profilaktychna toksykolohiya ta medychna ekolohiya. Vybrani lekcii dlya naukovciv, likariv ta studentiv za zahal'noyu redakciyeyu akademika NAMY Ukrainy I.M. Trakhtenberha. K.: VD “AVICENA”, 2011. — 320 s.
8. Plokhinskij N.A. Biometriya 2-e izd. / N.A. Plokhinskij. — M.: Izd-vo MGU, 1970. — 367 s.
9. Shtol'c K.F. Amperometricheskoe opredelenie ferrocianada v prisutstvii subkletochnykh struktur / K.F. Shtol'c, I.M. Mosolova, JI.A. Dronova // Biokhimicheskie metody. — M.: Nauka, 1980. — S. 147–150.
Надійшла до редакції 19.08.2014 p.