The toxic action of ozone on bacterium Staphylococcus aureus, funguses Candida albicans end spore shape Bacillus subtilis

  • Authors: I.A. Belykh, I.P. Vysekantsev, A.M. Grek, O.V. Sakun, V.V. Maruschenko
  • UDC: 615.372:579.842.11.243
Download attachments:

1И.А. Белых, к.биол.н., 2И.П. Высеканцев, к.мед.н., 1А.М. Грек, к.биол.н. 1А.В. Сакун, к.биол.н., 1В.В. Марущенко, к.биол.н.

1Национальный технический университет "Харьковский политехнический институт"
2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков

SUMMARY. The toxic effect of ozone on microorganisms is manifested in twophase of its operation. In the first phase of the accumulation of ozone dose in microorganisms. In vtorots — rapid death of microorganisms on the principle of "toksodoza-effect". The toxic effect of ozone depends on the type of microorganisms, incubation medium and regimes ozonation.
Кеу words: microorganism, ozone, toxicity.

Полученные результаты по токсическому действию озона на бактерии Escherichia coli [1-3] являются основанием для проведения дальнейших экспериментов по изучению токсико-инактивирующего действия озона на другие таксономические группы микроорганизмов в различных растворах.

В представленной статье приведены данные по изучению токсических свойств озона по отношению к таким микроорганизмам: Staphylococcus aureus, дрожжеподобным грибам Candida albicans и споровым формам Bacillus subtilis [4, 7, 14].

Материалы и методы

Для исследований использовали культуры бактерий Staphylococcus aureus, штамм 209, полученные из коллекции Харьковского института иммунологии, вакцин и сывороток АМН Украины. Bacillus subtilis АТСС 6633 и дрожжеподобные грибы Candida albicans АТСС 835-653 (2 последних штамма получены из коллекции АОЗТ "Здоровье").

Эксперименты с указанными микроорганизмами проводили согласно методам, подробно описанным в статье И.А. Белых и др. [3].

Результаты и обсуждения

В первой серии экспериментов (как и для Е. coli) исследовали жизнеспособность микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры с последующим обезвоживанием, после выдерживания их в озоно-воздушной смеси в течение различного времени при комнатной температуре. Контролем служили образцы микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры, которые инкубировали в воздушной среде. В табл. 1 представлены результаты определения жизнеспособности микроорганизмов, выраженной как число КОЕ/мл, после инкубирования их в течение 1, 3 и 6 часов в озоно-воздушной смеси с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С.

Таблица 1

Жизнеспособность микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры после инкубирования в течение различного времени в озоно-воздушной смеси с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С

Как видно из представленных результатов, после инкубирования в газовой среде с озоном в течение первого часа жизнеспособность всех исследованных микроорганизмов снижается в среднем на порядок. Число КОЕ/мл бактерий Staphуlococcus aureus после озонирования в озоно-воздушной среде через 3 часа снижается с 2,1·107 до 4,6·104. Через 6 часов бактерии Staphylococcus aureus погибают. Число КОЕ/мл грибов Candida albicans снижается через 3 часа с 5,1·107 до 2,9·103. Через 6 часов клетки дрожжеподобных грибов погибают.

Подобным образом исследовали воздействие озоно-воздушной смеси на указанные выше микроорганизмы, высеянные на агаризованные среды. Для бактерий Staphylococcus aureus в качестве среды использовали (МПА), для дрожжепо-добных грибов Candida albicans — агар Сабуро. Образцы в чашках Петри инкубировали в озоно-воздушной смеси с концентрацией озона 6,8 мг/л в течение 1, 3 и 6 часов при температуре 20°С. После обработки озоно-воздушной смесью микроорганизмы инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С и 48 часов при 30°С соответственно, далее подсчитывали число КОЕ/мл [8]. Результаты этого раздела исследований представлены в табл. 2.

Таблица 2

Жизнеспособность микроорганизмов, высеянных на агаризованные среды, после инкубирования среды с микроорганизмами в течение различного времени в озоно-воздушной смеси с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С

Как видно из табл. 2, инкубирование микроорганизмов, высеянных на поверхность агаризованных сред в озоно-воздушной смеси в течение 1 часа при указанных выше условиях не влияет на число КОЕ/мл. После инкубирования в течение 3 часов наблюдается достоверное снижение числа КОЕ/мл для бактерий Staphylococcus aureus в среднем в 10 раз, а для дрожжепо-добных грибов Candida albicans — в 100 раз. После инкубирования в течение 6 часов все изучавшиеся микроорганизмы погибают.

В последующей серии экспериментов исследовали действие обработки озоном указанных выше микроорганизмов в водных средах — дистиллированной воде, физиологическом растворе и питательных средах. В качестве питательных сред для бактерий Staphylococcus aureus использовали МПБ, для дрожжеподобных грибов Candida albicans — жидкую среду Сабуро. Клетки в водных средах подвергали действию озона двумя способами. Первый способ состоял в том, что жидкие среды с высеянными в них микроорганизмами барботировали озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С в течение 10, 20 и 60 мин, после каждого указанного временного интервала отбирали пробы и высевали их для определения количества жизнеспособных микроорганизмов. При втором способе исследования проводили барботирование жидких сред без микроорганизмов озоно-кислородной смесью при тех же условиях, что и в первом способе для растворения озона в жидкости. Далее в среды с озоном вносили микроорганизмы и инкубировали их при температуре 20°С также 10, 20, 60 минут. В процессе инкубации периодически отбирали пробы и высевали для определения количества жизнеспособных клеток микроорганизмов и для подсчета числа КОЕ/мл.

В табл. 3 представлены результаты определения жизнеспособности бактерий Staphylococcus aureus, суспендированных в различных жидких средах после обработки их озоно-кислородной смесью путем барботирования.

Таблица 3

Жизнеспособность бактерий Staphylococcus aureus, суспендированных в различных жидких средах при барботировании суспензии озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С

Как видно из табл. 3, максимальный бактерицидный эффект проявлялся при барботировании клеток Staphylococcus aureus в физиологическом растворе, минимальный эффект — при барботировании в МПБ. Полная гибель бактерий наблюдалась после барботирования в течение 60 минут в дистиллированной воде и физиологическом растворе.

Аналогичные результаты были получены и в экспериментах с барботированием суспензий дрожжеподобных грибов Candida albicans (табл. 4) и споровых форм Bacillus subtilis (табл. 5)

Таблица 4

Жизнеспособность дрожжеподобных грибов Candida albicans, суспендированных в различных жидких средах при барботировании суспензии озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С

Таблица 5

Жизнеспособность споровых форм бактерий Bacillus subtilis в споровой форме, суспендированных в различных жидких средах при барботировании суспензии озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С

Как и в предыдущих экспериментах с бактериями Staphylococcus aureus, дрожжеподобные грибы Candida albicans и споровые формы бактерий Bacillus subtilis не погибают полностью в среде МПБ после барботирования озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°C. В дистиллированной воде и в физиологическом растворе при этих условиях обработки озоном происходит полная гибель данных микроорганизмов, соответственно через 90 и 120 минут. Споровая форма Bacillus subtilis менее чувствительна к действию озона по сравнению с другими видами исследованных нами вегетативных форм микроорганизмов. Для полной гибели споровой формы Bacillus subtilis необходимо было увеличить время обработки озоно-кислородной смесью при указанных выше условиях до 120 минут.

В следующей серии экспериментов было проведено изучение влияния суспензионных сред, обработанных озоном, на жизнеспособность микроорганизмов. Физиологический раствор, дистиллированную воду, МПБ и бульон Сабуро обрабатывали озонокислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л путём барботирования в течение 60 минут при температуре 20°C.

После этого микроорганизмы Staphylococcus aureus, Candida albicans и Bacillus subtilis вносили в среды, содержащие растворенный озон.

Полученные суспензии инкубировали при температуре 20°C в течение 10, 30, 60 минут (Staphylococcus aureus, Candida albicans) или 60, 90, 120 мин (споровые формы Bacillus subtilis) и определяли количество жизнеспособных клеток на 1 мл суспензии.

Жизнеспособность микроорганизмов Staphylococcus aureus и Candida albicans в обработанных озоном дистиллированной воде и в физиологическом растворе снижается в течение 60 мин на шесть порядков. В средах МПБ и Сабуро, обработанных озоном, степень снижения жизнеспособности указанных микроорганизмов за то же время на порядок меньше. Споровые формы Bacillus subtilis характеризуются более высокой устойчивостью в обработанных озоном средах, по сравнению с микроорганизмами в вегетативной форме. Степень снижения жизнеспособности Bacillus subtilis в таких средах составляет четыре порядка при инкубации в течение 120 мин. Меньшая степень снижения жизнеспособности микроорганизмов в обработанных озоном водных средах по сравнению с прямым барботированием озоно-кислородной смесью объясняется распадом растворенного озона согласно реакции: 2О3↔3О2. Одновременно озон может расходоваться на реакции с органическими веществами в средах инкубации микроорганизмов (МПБ, среда Сабуро).

Сравнительная оценка действия озона на жизнеспособность микроорганизмов разных видов и в различных средах может быть проведена на основании анализа кинетики гибели микроорганизмов. Для такой оценки, используя измерения чисел КОЕ/мл в описанных выше экспериментах, мы построили кинетические кривые гибели микроорганизмов в виде зависимостей lg Nt/N0=f (t), где Nt и N0 — число КОЕ/мл после обработки и до обработки озоном, соответственно, и t — время [2, 13].

На рис. 1-3 представлены кинетические кривые гибели микроорганизмов Staphylococcus aureus, Candida albicans и Bacillus subtilis (споровая форма).

Рис. 1. Кинетические кривые гибели бактерий Staphylococcus aureus при обработке озоно-кислородной смесью. Сплошные линии — при барботировании суспензий бактерий в дистиллированной воде (1), в 0,9% растворе хлористого натрия (2) и в МПБ (3) озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С. Пунктир — при инкубации микроорганизмов, высеянных в те же среды: дистиллированная вода (4), 0,9% раствор хлористого натрия (5) и МПБ (6), обработанные предварительно в течение 30 мин барботированием озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С

Рис. 2. Кинетические кривые гибели дрожжеподобных грибов Candida albicans при обработке озоно-кислородной смесью. Сплошные линии — при барботировании суспензий дрожжеподобных грибов в дистиллированной воде (1), в 0,9% растворе хлористого натрия (2) и в МПБ (3) озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С. Пунктир — при инкубации дрожжеподобных грибов, высеянных в те же среды: дистиллированная вода (4), 0,9% раствор хлористого натрия (5) и МПБ (6), обработанные предварительно в течение 30 мин барботированием озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С

Рис. 3. Кинетические кривые гибели споровых форм Bacillus subtilis при обработке озоно-кислородной смесью. Сплошные линии — при барботировании суспензий Bacillus subtilis в дистиллированной воде (1), в 0,9% растворе хлористого натрия (2) и в МПБ (3) озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С. Пунктир — при инкубации Bacillus subtilis, высеянных в те же среды: дистиллированная вода (4), 0,9% раствор хлористого натрия (5) и МПБ (6), обработанные предварительно в течение 30 мин барботированием озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л при температуре 20°С

Анализируя полученные результаты, можно видеть, что выраженность бактерицидного действия озона в значительной степени зависит от среды, в которой находятся микроорганизмы. Среди исследованных в настоящей работе сред летальное действие газообразного озона на микробные клетки более всего выражено при непосредственном контакте озона с клетками микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры. Число КОЕ/мл в данных условиях через 3 часа контакта с газообразной озоно-воздушной средой снижается на 4 порядка. Полная гибель микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры, происходит между 3-6 часами инкубации в атмосфере, содержащей газообразный озон в концентрации 6,8 мг/л при температуре 20°С.

При действии озона на микроорганизмы, высеянные на поверхность агаризованных сред, полная гибель микроорганизмов происходит через 6 часов. Однако темп снижения жизнеспособности микроорганизмов в процессе обработки газообразным озоном в данном случае меньше, чем в рассмотренном выше случае микроорганизмов, нанесенных на миллипоровые фильтры. Об этом свидетельствует меньший наклон кинетических кривых (рис. 1-3).

По-видимому, озон вступает во взаимодействие с компонентами питательных сред, содержащих различные органические макромолекулы (белки, аминокислоты, углеводы), а также агар-агар в коллоидном состоянии и соли. В результате концентрация озона, контактировавшего с микробными клетками, существенно снижается. Нельзя исключить и образование вокруг микробных клеток своеобразных защитных зон из компонентов ростовых сред, контактирующих с поверхностью микробных клеток. На возможность существования такого механизма указывают данные [6, 12], о снижении летального действия озона за счет органических соединений.

Наиболее выраженный эффект инактивации микроорганизмов наблюдался в серии экспериментов, в которых клетки микроорганизмов, суспендированные в жидких средах, подвергались интенсивному барботированию озоном. В таких условиях гибель вегетативных форм бактерий Staphylococcus aureus и дрожжеподобных грибов Candida albicans наблюдается уже через 10 минут, а полная гибель происходит между 20-60 минутой барботирования. Повреждающее влияние барботирования в суспензионных средах на споровые формы Bacillus subtilis менее выражено. Гибель споровых форм Bacillus subtilis происходит между 90-120 минутами барботирования. Эти данные несколько отличаются от цитируемых рядом авторов результатов [4, 5, 7, 9, 11], в которых гибель спор происходит через более короткое время. Однако авторы этих сообщений ссылаются на эксперименты, проведенные со спорами актиномицетов (нитчатая форма бактерий) и грибов, а, как известно [10], споры актиномицетов и грибов являются одним из этапов репродукции этих микроорганизмов и существенно отличаются по устойчивости к физико-химическим факторам от эндоспор, продуцируемых спорообразующими видами бактерий. В этой серии экспериментов также было установлено, что выраженность летального действия барботирования озоно-кислородной смесью зависит от состава суспензионных сред. Наиболее выраженный летальный эффект наблюдается при барботировании суспензии микроорганизмов в физиологическом растворе. При барботировании суспензий микроорганизмов в дистиллированной воде количество погибших микробных клеток несколько меньше. Это видно из наклона соответствующих кинетических кривых на рис. 1-3. В МПБ и в жидкой среде Сабуро количество КОЕ/мл снижается через 60 минут (для вегетативных форм) и через 120 минут (для споровых форм) на 5 порядков, но полной гибели не происходит. По-видимому, и в этих условиях белки, аминокислоты, углеводы и другие соединения, входящие в состав МПБ и жидкой среды Сабуро, ослабляют повреждающее действие озона путем химических реакций с озоном или препятствуя контакту озона с поверхностью микробных клеток.

 

ЛІТЕРАТУРА

1. Белых И. А. Влияние озонированной питательной среды на кинетику роста и отмирания культуры Escherichia coli / И.А. Белых, И.П. Высеканцев, В.Д. Зинченко, С.В. Казанжан // Збірник наукових робіт ІІІ Української науково-практичної конференції з міжнародною участю "Місцеве та парентеральне використання озонотерапії в медицині", Харків, 2003. — С. 42.

2. Белых И.А. Влияние озонированных сред инкубирования и культивирования на кинетику роста и отмирания периодической культуры Escherichia coli / И.А. Белых // Актуальные проблемы медицины и биологии. —2004. — № 1. — С. 397-402.

3. Белых И.А. Токсическое действие озона на бактерии Escherichia coli / И.А. Белых, И.П. Высеканцев, А.М. Грек, А.В. Сакун, В.В. Марущенко — 2009. — № 1 — С. 48-53.

4. Гончарук В. В. Озонирование как метод подготовки питьевой воды: возможные побочные продукты и токсикологическая оценка / В.В. Гончарук, Н.Г. Потапченко, B.Ф. Вакуленко // Химия и технология воды. — 1995. — Т. 17, № 1. —C. 3-33.

5. Григорьева Л. Н. Гигиенические аспекты изменения свойств микробиоценозов окружающей среды при радиоактивном загрязнении / Л.Н. Григорьева, Г.Н. Корчак, Т.В. Бей, М.Ю. Антонов // Химия и технология воды. — 1995. — № 1. — С. 88-91.

6. Емельянова Г. Н. К вопросу о кинетике и механизме некоторых реакций концентрирования озона. Современные проблемы физической химии, т. 2. Вопрос о кинетике химических реакций / Г.Н. Емельянова, Б.В. Страхов. — М. : МГУ, 1968. — С. 149-172.

7. Кожинов В.Ф. Очистка питьевой и технической воды / В.Ф. Кожинов. — М.: Стройиздат, 1971. — 301 с.

8. Лабинская В.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований // В.С. Лабинская. — М.: Медицина, 1978. — 394 с.

9. Орлов В.А. Озонирование воды / В.А. Орлов. — М.: Стройиздат, 1984. — 88 с.

10. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / О.К. Поздеев. — М. : ГЭОТАР МЕД, 2001. — 768 с.

11. Прокопов В.А. Пути решения проблемы очистки фильтрата свалки твердых бытовых отходов г. Киева / В.А. Прокопов, Г.В. Толстопятов, Э.Д. Мактаз // Химия и технология воды. — 1995. — Т. 17, № 1. — С. 43-45.

12. Разумовский С.Д. Озон и его реакции с органическими соединениями / С.Д. Разумовский, Г.Е. Заиков. — М.: Наука, 1974. — 322 с.

13. Стейниер Р. Мир микробов / Р. Стейниер, Э. Эдельберг, Дж. Ингрэм — М.: Мир, 1979. — 486 с.

14. Achen M., Efficacy of ozone against Escherichia coli 0157:H7 on apples / M. Achen, A. E. Yousef // J Food Sci. — 2001. — Vol. 66, № 9. — P. 1380-1384.

 

REFERENCES

1. Belykh I. A. Vliyanie ozonirovannoj pitatel'noj sredy na kinetiku rosta i otmiraniya kul'tury Escherichia coli / I.A. Belykh, I.P. Vysekancev, V.D. Zinchenko, S.V. Kazanzhan // Zbirnyk naukovykh robit III Ukrains'koi naukovo-praktychnoi konferencii z mizhnarodnoyu uchastyu "Misceve ta parenteral'ne vykorystannya ozonoterapii v medycyni", Kharkiv, 2003. — S. 42.

2. Belykh I.A. Vliyanie ozonirovannykh sred inkubirovaniya i kul'tivirovaniya na kinetiku rosta i otmiraniya periodicheskoj kul'tury Escherichia coli / I.A. Belykh // Aktual'nye problemy mediciny i biologii. —2004. — № 1. — S. 397-402.

3. Belykh I.A. Toksicheskoe dejstvie ozona na bakterii Escherichia coli / I.A. Belykh, I.P. Vysekancev, A.M. Grek, A.V. Sakun, V.V. Maruschenko — 2009. — № 1 — S. 48-53.

4. Goncharuk V. V. Ozonirovanie kak metod podgotovki pit'evoj vody: vozmozhnye pobochnye produkty i toksikologicheskaya ocenka / V.V. Goncharuk, N.G. Potapchenko, B.F. Vakulenko // Khimiya i tekhnologiya vody. — 1995. — T. 17, № 1. —C. 3-33.

5. Grigor'eva L. N. Gigienicheskie aspekty izmeneniya svojstv mikrobiocenozov okruzhayuschej sredy pri radioaktivnom zagryaznenii / L.N. Grigor'eva, G.N. Korchak, T.V. Bej, M.Yu. Antonov // Khimiya i tekhnologiya vody. — 1995. — № 1. — S. 88-91.

6. Emel'yanova G. N. K voprosu o kinetike i mekhanizme nekotorykh reakcij koncentrirovaniya ozona. Sovremennye problemy fizicheskoj khimii, t. 2. Vopros o kinetike khimicheskikh reakcij / G.N. Emel'yanova, B.V. Strakhov. — M. : MGU, 1968. — S. 149-172.

7. Kozhinov V.F. Ochistka pit'evoj i tekhnicheskoj vody / V.F. Kozhinov. — M.: Strojizdat, 1971. — 301 s.

8. Labinskaya V.S. Mikrobiologiya s tekhnikoj mikrobiologicheskikh issledovanij // V.S. Labinskaya. — M.: Medicina, 1978. — 394 s.

9. Orlov V.A. Ozonirovanie vody / V.A. Orlov. — M.: Strojizdat, 1984. — 88 s.

10. Pozdeev O.K. Medicinskaya mikrobiologiya / O.K. Pozdeev. — M. : GEOTAR MED, 2001. — 768 s.

11. Prokopov V.A. Puti resheniya problemy ochistki fil'trata svalki tverdykh bytovykh otkhodov g. Kieva / V.A. Prokopov, G.V. Tolstopyatov, E.D. Maktaz // Khimiya i tekhnologiya vody. — 1995. — T. 17, № 1. — S. 43-45.

12. Razumovskij S.D. Ozon i ego reakcii s organicheskimi soedineniyami / S.D. Razumovskij, G.E. Zaikov. — M.: Nauka, 1974. — 322 s.

13. Stejnier R. Mir mikrobov / R. Stejnier, E. Edel'berg, Dzh. Ingrem — M.: Mir, 1979. — 486 s.

14. Achen M., Efficacy of ozone against Escherichia coli 0157:H7 on apples / M. Achen, A. E. Yousef // J Food Sci. — 2001. — Vol. 66, № 9. — P. 1380-1384.

Надійшла до редакції 22.04.2010