Фармакотерапія і профілактика туберкульозу вимагають своєчасного та активного застосування найбільш ефективних і безпечних лікарських засобів [1]. Сучасна терапія даного захворювання включає використання протитуберкульозних лікарських засобів (ПТЛЗ) І ряду, які поєднують високу антимікробну активність щодо Micobacterium tuberculosis та помірну токсичність. Однак, тривале застосування даних препаратів може викликати розвиток ряду побічних реакцій, механізми яких досліджені недостатньо [2, 3]. Метою даної роботи було дослідження ролі І фази біотрансформації та антиоксидантного статусу у формуванні гепатотоксичної дії комбінації ПТЛЗ у щурів.
Матеріали та методи
Субстанції етамбутолу, піразинаміду, ізоніазиду та рифампіцину були надані ЗАТ НВЦ "Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод".
У дослідженнях використані щури-самці лінії Вістар масою тіла 150-170 г. Дві групи щурів (не менше 5 в кожній) формували за методом рандомізації з попередньою акліматизацією протягом 10 днів: 1-а група — внутрішньошлункове сумісне введення ПТЛЗ в 1% крохмальному гелі; 2-а — контроль (внутрішньошлункове введення 1% крохмального гелю). ПТЛЗ вводили в дозах, що застосовують у клініці для короткотермінової комбінованої терапії туберкульозу з урахуванням коефіцієнта видової чутливості: етамбутол — 155 мг/кг, рифампіцин — 74,4 мг/кг, ізоніазид — 62 мг/кг, піразинамід — 217 мг/кг протягом 60 днів [4, 5]. Через 24 години після останнього введення ПТЛЗ тварин знеживлювали методом цервікальної дислокації під легким ефірним наркозом.
У сироватці крові на біохімічному аналізаторі Prestige 24i (Японія) досліджували активність лужної фосфатази (ЛФ), а також вміст загального білірубіну, використовуючи біотести виробництва фірми " P. Z. Cormay", Польща.
Експресію мРНК цитохромів Р-450 2Е1 (CYP2E1), 2С23 (CYP2C23) (ортолог CYP2С19 та CYP2С9) та 3А2 (CYP3A2) (ортолог CYP3А4) у печінці визначали методом зворотньо-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції з використанням специфічних праймерів, як це було описано раніше [6]. Ампліфікацію проводили на термоциклері MyCycler виробництва BioRaD, США.
Електрофорез нуклеїнових кислот проводили в 2 % агарозному гелі та фарбували розчином бромового етидію, візуалізували в УФ-світлі, фотографували за допомогою системи GelDoc, виробництва BioRaD, США та аналізували в системі Quantity One BioRad System (США).
З метою виділення постмітохондріальної та мікросомної фракцій печінку відмивали через воротну вену охолодженим 0,15 М розчином КСІ, гомогенізували та піддавали центрифугуванню у градієнті солей [7]. Усі процедури виконували з дотриманням холодового режиму (4oC).
У фракції мікросом печінки визначали загальний вміст цитохромів Р-450, п-нітрофенолгідроксилазну активність, а також вміст відновленого глутатіону у печінці, як це було описано раніше [6]. Швидкість НАДФН-залежного утворення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реактанти) визначали за методом І.Д. Стальної та Т. Г Гаришвілі [8]. У постмітохондріальній фракції печінки досліджували глутатіон-S-трансферазну та глутатіонредуктазну активності [9]. Активність каталази в гомогенаті печінки визначали за методом М.А. Королюк та співавт. [10]. Білок визначали за методом O.H. Lowry та співавт. [11].
Статистичний аналіз результатів експерименту проводили з використанням t-критерію Стьюдента. Дані представляли як середнє арифметичне значення та похибку середнього арифметичного (M±m). Різницю між досліджуваними показниками вважали статистично достовірною при значенні р<0,05.
Результати та обговорення
Вивчення біохімічних показників сироватки крові щурів-самців за умов сумісного введення ПТЛЗ виявило зростання вмісту загального білірубіну у 4,6 раза та активності лужної фосфатази у 1,6 раза у порівнянні з контролем (табл. 1). Ці дані свідчать про здатність протитуберкульозних засобів спричиняти лікарський гепатит за холестатичним типом, який, як відомо, характеризується затримкою жовчі в гепатоцитах та жовчних шляхах [12].
Таблиця 1
Вміст загального білірубіну та активності лужної фосфатази в сироватці крові самців щурів за умов сумісного введення етамбутолу, ізоніазиду, піразинаміду та рифампіцину протягом 60 днів (M±m, n>5)
Одночасно було досліджено вплив комбінації ПТЛЗ на рівень експресії цитохромів CYP2E1, CYP3A2 та CYP2C23 в печінці щурів (рис.) та деякі показники функціонування системи цитохрому Р-450 (табл. 2).
Рис. Відносний рівень експресії ізоформ CYP2Е1, CYP3А2 та CYP2С23 у печінці щурів
(б) та електрофореграми, що відображають рівень її експресії ізоформ (а) за умов сумісного введення етамбутолу, ізоніазиду, піразинаміду та рифампіцину протягом 60 днів
Таблиця 2
Деякі показники функціонування системи цитохрому Р-450 в мікросомах печінки щурів за умов сумісного введення етамбутолу, ізоніазиду, піразинаміду та рифампіцину протягом 60 днів (M±m, n>5)
Показано, що введення комбінації туберку-лостатиків призводило до зростання експресії мРНК цитохромів Р-450 2Е1 та 3А2 в печінці піддослідних щурів у 2,4 і 1,8 раза відповідно, тоді як рівень експресії цитохрому Р-450 2С23 знижувався в 4 рази порівняно з контролем.
Отримані нами результати узгоджуються з даними літератури, які свідчать, що такі складові комбінації ПТЛЗ як рифампіцин є індуктором ізоформ СYP2Е1, CYP3А та CYP2С [13]; ізоніазид здатен індукувати СYP2Е1 [14] та інгібувати ізоформи CYP3А та CYP2С [15], а піразинамід у високих дозах — індуктор CYP2Е1 [16]. Отже, в даному випадку можна припустити наявність індукуючої дії ізоніазиду та піразинаміду на ізоформу CYP2Е1, ри-фампіцину — на ізоформи CYP2Е1, CYP3А2 та CYP2С23, а також інгібування активності ізоформ CYP3А2 та CYP2С23 ізоніазидом. Слід зазначити, що зростання експресії мРНК СYР 2Е1 у печінці було прямопропорційним активності п-нітрофенолгідроксилази, як маркера CYP2Е1, яка в групі піддослідних тварин була вищою у 4 рази порівняно з контролем. Отримані дані щодо індукції CYP2Е1 є важливими з огляду на визначну роль даної ізоформи в механізмах розвитку гепатотоксичності ксенобіотиків [17].
Одночасно у мікросомах печінки дослідних тварин за умов сумісного введення ПТЛЗ на 20% збільшувався загальний вміст цитохрому Р-450, що можна віднести на рахунок індукції CYP 2E1 та CYP 3A2.
Відомо, що в результаті активації ферментів монооксигеназної системи в ході біотрансформації лікарських засобів за участі системи цитохрому Р-450, можуть утворюватись токсичні метаболіти та активні форми кисню [18]. Дійсно, нами було показано, що за умов сумісного введення ізоніазиду, рифампіцину, піразинаміду та етамбутолу швидкість НАДФН-залежного утворення ТБК реактантів у мікросомах печінки щурів зростала на 40% у порівнянні з контролем (табл. 2.), що свідчить про активацію ліпопереокислення [19].
У випадку дії на організм ксенобіотиків, найбільш надійними критеріями стану системи детоксикації можуть слугувати активність глутатіонзалежних ферментів та рівень відновленого глутатіону [20]. Нами було зареєстровано модуляцію тіолового статусу печінки, а саме — введення щурам комбінації ПТЛЗ викликало тенденцію зростання глутатіон-S-трансферазної активності, збільшення вмісту відновленого глутатіону та глутатіонредуктазної активності в печінці на 39% та 40% відповідно (табл. 3), що можна розглядати як компенсаторний ефект, спрямований на знешкодження активних форм кисню та продуктів вільнора-дикального окиснення [21].
За даних умов експерименту каталазна активність у печінці щурів дослідної групи зростала вдвічі порівняно з контрольною групою (табл. 3).
Таблиця 3
Показники, що характеризують каталазну активність та тіоловий статус печінки щурів за умов сумісного введення етамбутолу, ізоніазиду, піразинаміду та рифампіцину протягом 60 днів (M±m, n>5)
Це цілком узгоджується з даними інших авторів, які на клітинах HepG2 показали, що за умов надмірної експресії цитохрому Р-450 2Е1 у 2 рази збільшується активність каталази та відбувається індукція альфа- та глутатіон-S-трансфераз мікросом, що, на думку авторів, є адаптивною відповіддю на ініційований CYP2Е1 оксидативний стрес [22]. Активація ПОЛ одночасно стимулює антиоксидантну систему, спрямовану на підтримку про- та антиоксидантного гомеостазу в клітині [23].
Висновок
Сумісне введення етамбутолу, ізоніазиду, піразинаміду та рифампіцину у терапевтичних дозах призводить до збільшення вмісту загального білірубіну та активності лужної фосфатази в сироватці крові щурів, що свідчить про пошкодження печінки за холестатичним типом. Виявлена модуляція експресії ізоформ цитохрому Р-450, а саме — індукція ізоформ CYP2Е1 та CYP3А2 при одночасному інгібуванні ізоформи CYP2С23 у печінці. Збільшення каталазної активності паралельно з активацією ферментативного ПОЛ та порушенням глутатіонової системи може свідчити про активацію антиоксидантної системи, спрямованої на підтримку рівноваги прооксидантно-антиоксидатного статусу печінки.
Отримані дані сприяють розумінню механізмів токсичного впливу ПТЛЗ на печінку за умов їх сумісного застосування та є обгрунтуванням розробки гепатопротекторних засобів, здатних впливати на метаболічні процеси, пов'язані з функціонуванням системи цитохрому Р-450.
ЛІТЕРАТУРА
1. Оценка значимости побочных реакций противотуберкулезных препаратов при лечении туберкулеза / Ю. И. Фещенко, С. А. Черенько, В. И. Мальцев [и др.] // Укр. Мед. Часопис. — 2008. — Том 65, № 3. — С.117 — 125.
2. Мишин В.Ю. Побочное действие противотуберкулезных препаратов при стандартных и индивидуальных режимах химиотерапии / В.Ю. Мишин, В.И. Чуканов, Ю.Г. Григорьев. — М.: "Компьютербург", 2004. — 208с.
3. Машковский, М. Д. Лекарственные средства: В 2 т. Т.2. — 14-е изд., перераб., испр. и доп. [Текст] / М. Д. Машковский. — М.: ООО "Издательство Новая Волна", 2000. — 608 с.
4. Страчунский Л.С. Антимикробная терапия [Електронний ресурс]: руководство для врачей / Л.С. Страчунский, С.Н Козлов. — М.: Боргес, 2002. — 431с. — Режим доступу: http:// www.antibiotic.ru
5. Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers U.S. Department of Health and Human Services, FDA, CDER and CBER [Електронний ресурс]. — Режим доступу: http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm
6. Деякі механізми гепатотоксичності етамбутолу у щурів / С.І. Анісімова, В.М. Коваленко, Л.Б. Бондаренко [та ін.] // Фармакологія та лікарська токсикологія. — 2011. — №4. — С. 7 — 12.
7. Kamath S.A. A simple method for the isolation of rat liver microsomes / S.A. Kamath, F.A. Kummerow, K.A. Narayan // FEBS Letters. — 1971. — V.17, №1. — P. 90 — 92.
8. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили; под ред. В.Н. Ореховича // Современные методы в биологии. — М.: Медицина, 1977. — С. 66 — 68.
9. Current Protocols in Toxicology / Ed. by M. Maines, John Wiley & Sons, Inc. — 2005. — P. 2758.
10. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова [и др.] // Лабораторное дело. — 1988. — №1. — С. 16 — 19.
11. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebroughch, A.L. Farr [et al.] // J. Biol. Chem. — 1951. — V.193. — P. 265 — 275.
12. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / В.С. Камышников —М.: МЕД пресс-информ, 2004. — 911 с.
13. Effects of prototypical microsomal enzyme inducers on cytochrome P450 expression in cultured human hepatocytes / A. Madan, R.A. Graham, K.M. Carroll [et al.] // Drug metabol. Dispos. — 2003. — V. 31, №4. — P. 421 — 431.
14. Bibi Z. Role of cytochrome P450 in drug interactions / Z. Bibi // Nutr. Metab. — 2008. — V. 5. — P. 27 — 36.
15. Desta Z. Inhibition of cytochrome P450 (CYP450) isoforms by isoniazid: potent inhibition of CYP2C19 and CYP3A4 / Z. Desta, N.V. Soukhova, D.A. Flockhart // Antimicrob. Agents Chemother. — 2001. — V. 45, №2. — P. 382 — 392.
16. Dose-dependent effects of pyrazinamide on liver cytochrome P-450 2E1 / V. Кovalenko, L. Bondarenko, A. Matvienko [et al.] // Acta Toxicologica. — 2007. — V. 15, №2. — P. 1 — 8.
17. Сharles S. Lieber. Cytochrome P-4502Е1: Its Physiological and Pathological Role / Сharles S. Lieber. // Physiological Reviews. — 1997. —V. 77, № 2. —P. 517—544.
18. Активированные кислородные метаболиты в монооксигеназных реакциях / В.В. Ляхович, В.А. Вавилин, Н.К. Зенков [и др.] // БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН. — 2005. — № 4 (118). — С. 7 — 12.
19. Cytochrome P450 2E1 expression induces hepatocyte resis-tanse to cell death from oxidative stress / B.E. Jones, H. Liu, C.R. Lo [et al.] // Antioxid. Redox. Signal. — 2002. — V.4, №5. — Р. 701 — 709.
20. Jung K.A. The Nrf2 system as a potential target for the development of indirect antioxidants / K.A. Jung, M.K. Kwak // Molecules. — 2010. — V.15, №10. — P. 7266 — 7291.
21. Caro A.A. Oxidative stress, Toxicology, and Pharmacology of CYP2E1 / A.A. Caro, A.I. Cederbaum // Annual Review of Pharmacology and Toxicology. — 2004. — V.44. — P.27 — 42.
22. Mari M. Induction of catalase, alpha, and microsomal glu-tathione S-transferase in CYP2E1 overexpressing HepG2 cells and protection against short-term oxidative stress / M. Mari, A.I. Cederbaum // Hepatology. — 2001. — V.33, №3. — P. 652 — 661.
23. Calabrese E.J. Catalase: its role in xenobiotic detoxification / E.J. Calabrese, A.T. Canada // Pharmacol. Ther. — 1989. — V. 44, №2. — P. 297 — 307.
REFERENCES
1. Ocenka znachimosti pobochnykh reakcij protivotuberkuleznykh preparatov pri lechenii tuberkuleza / Yu. I. Feschenko, S. A. Cheren'ko, V. I. Mal'cev [i dr.] // Ukr. Med. Chasopis. — 2008. — Tom 65, № 3. — S.117 — 125.
2. Mishin V.Yu. Pobochnoe dejstvie protivotuberkuleznykh preparatov pri standartnykh i individual'nykh rezhimakh khimioterapii / V.Yu. Mishin, V.I. Chukanov, Yu.G. Grigor'ev. — M.: "Komp'yuterburg", 2004. — 208s.
3. Mashkovskij, M. D. Lekarstvennye sredstva: V 2 t. T.2. — 14-e izd., pererab., ispr. i dop. [Tekst] / M. D. Mashkovskij. — M.: OOO "Izdatel'stvo Novaya Volna", 2000. — 608 s.
4. Strachunskij L.S. Antimikrobnaya terapiya [Elektronnij resurs]: rukovodstvo dlya vrachej / L.S. Strachunskij, S.N Kozlov. — M.: Borges, 2002. — 431s. — Rezhim dostupu: http:// www.antibiotic.ru
5. Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers U.S. Department of Health and Human Services, FDA, CDER and CBER [Електронний ресурс]. — Режим доступу: http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm
6. Deyaki mekhanizmy gepatotoksychnosti etambutolu u schuriv / S.I. Anisimova, V.M. Kovalenko, L.B. Bondarenko [ta in.] // Farmakologiya ta likars'ka toksykologiya. — 2011. — №4. — S. 7 — 12.
7. Kamath S.A. A simple method for the isolation of rat liver microsomes / S.A. Kamath, F.A. Kummerow, K.A. Narayan // FEBS Letters. — 1971. — V.17, №1. — P. 90 — 92.
8. Stal'naya I.D. Metod opredeleniya malonovogo dial'degida s pomosch'yu tiobarbiturovoj kisloty / I.D. Stal'naya, T.G. Garishvili; pod red. V.N. Orekhovicha // Sovremennye metody v biologii. — M.: Medicina, 1977. — S. 66 — 68.
9. Current Protocols in Toxicology / Ed. by M. Maines, John Wiley & Sons, Inc. — 2005. — P. 2758.
10. Metod opredeleniya aktivnosti katalazy / M.A. Korolyuk, L.I. Ivanova, I.G. Majorova [i dr.] // Laboratornoe delo. — 1988. — №1. — S. 16 — 19.
11. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebroughch, A.L. Farr [et al.] // J. Biol. Chem. — 1951. — V.193. — P. 265 — 275.
12. Kamyshnikov V.S. Spravochnik po kliniko-biokhimicheskim issledovaniyam i laboratornoj diagnostike / V.S. Kamyshnikov —M.: MED press-inform, 2004. — 911 s.
13. Effects of prototypical microsomal enzyme inducers on cytochrome P450 expression in cultured human hepatocytes / A. Madan, R.A. Graham, K.M. Carroll [et al.] // Drug metabol. Dispos. — 2003. — V. 31, №4. — P. 421 — 431.
14. Bibi Z. Role of cytochrome P450 in drug interactions / Z. Bibi // Nutr. Metab. — 2008. — V. 5. — P. 27 — 36.
15. Desta Z. Inhibition of cytochrome P450 (CYP450) isoforms by isoniazid: potent inhibition of CYP2C19 and CYP3A4 / Z. Desta, N.V. Soukhova, D.A. Flockhart // Antimicrob. Agents Chemother. — 2001. — V. 45, №2. — P. 382 — 392.
16. Dose-dependent effects of pyrazinamide on liver cytochrome P-450 2E1 / V. Кovalenko, L. Bondarenko, A. Matvienko [et al.] // Acta Toxicologica. — 2007. — V. 15, №2. — P. 1 — 8.
17. Сharles S. Lieber. Cytochrome P-4502Е1: Its Physiological and Pathological Role / Сharles S. Lieber. // Physiological Reviews. — 1997. —V. 77, № 2. —P. 517—544.
18. Aktivirovannye kislorodnye metabolity v monooksigenaznykh reakciyakh / V.V. Lyakhovich, V.A. Vavilin, N.K. Zenkov [i dr.] // BYuLLETEN' SO RAMN. — 2005. — № 4 (118). — S. 7 — 12.
19. Cytochrome P450 2E1 expression induces hepatocyte resis-tanse to cell death from oxidative stress / B.E. Jones, H. Liu, C.R. Lo [et al.] // Antioxid. Redox. Signal. — 2002. — V.4, №5. — Р. 701 — 709.
20. Jung K.A. The Nrf2 system as a potential target for the development of indirect antioxidants / K.A. Jung, M.K. Kwak // Molecules. — 2010. — V.15, №10. — P. 7266 — 7291.
21. Caro A.A. Oxidative stress, Toxicology, and Pharmacology of CYP2E1 / A.A. Caro, A.I. Cederbaum // Annual Review of Pharmacology and Toxicology. — 2004. — V.44. — P.27 — 42.
22. Mari M. Induction of catalase, alpha, and microsomal glu-tathione S-transferase in CYP2E1 overexpressing HepG2 cells and protection against short-term oxidative stress / M. Mari, A.I. Cederbaum // Hepatology. — 2001. — V.33, №3. — P. 652 — 661.
23. Calabrese E.J. Catalase: its role in xenobiotic detoxification / E.J. Calabrese, A.T. Canada // Pharmacol. Ther. — 1989. — V. 44, №2. — P. 297 — 307.
Надійшла до редакції 6.01.2012 р.