В.І. Жуков, Н.Г. Щербань, А.І. Безродна, Н.А. Ващук, С.А. Стеценко
Харківський національний медичний університет, м. Харків
SUMMARY. The aim is to study the general toxicity and effect on the body of warm-blooded animals sub-toxic doses of oligoetliers: L-3603-2-12 and L-10002-2-80 and study of the structural and metabolic slate of the liver and its detoxification function. Oligoesters dose 1/10 DL50 in the body of warm-blooded cause significant structural and metabolic disorders in the liver, which combined with its detoxification function. At a dose of 1/100 DL50 xenobiotics leads to the activation of metabolic processes and detoxification function. The DL50 oligoesters 1/1000 dose did not affect the metabolic activity and detoxification function of the liver. Analysis of estimated figures shows that prolonged exposure to L-3603-2-12 and L-10002-2-80 stimulates the body of experimental animals free radical processes, lipid peroxidation leads to the depletion of the antioxidant system and violation ofprotein, carbohydrate, lipid, and nucleic acid metabolism, which together are capable offormingfree radical membrane pathology, which is a leading link of degenerative processes in the inhibition of the detoxifying liver function.
Key words: simple oligoesters, metabolism, drug resistance, toxicity, environment.
Сьогодні віддалені наслідки майже безконтрольного скиду стічних вод у водойми та викидів в атмосферне повітря хімічної, нафтопереробної, фармацевтичної, електрохімічної, металургійної промисловості, а також використання у побуті великого асортименту хімічних засобів створило умови для інтенсивного забруднення навколишнього, виробничого та побутового середовища.
Прямим наслідком цього є численні приклади інтенсивного забруднення об'єктів довкілля населених місць і зниження загальної популяційної резистентності організму людини, що створює умови для виникнення широкого спектра захворювань. У системі пошуку та визначення профілактичних заходів з проблеми захисту здоров'я населення значну роль відіграє оперативна діагностика порушення гомеостатичної функції організму на ранніх етапах розвитку захворювань і патологічних станів. Методологічною основою при цьому може бути розробка і обґрунтування критеріально значимих показників, що віддзеркалюють молекулярно-мембранну патологію, яка є підгрунтям формування більшості екологічно обумовлених захворювань і патологічних станів [1].
У зв'язку з цим актуальним є вивчення механізмів біологічної дії та етапів структурно-метаболічних порушень, які виникають в організмі за впливу антропогенного хімічного навантаження, а також розробка засобів і принципів профілактики порушення гомеостатичної функції організму та її корекції [1]. Відомо, що значна кількість хімічних сполук володіє мембранотропною дією, формує розвиток вільнорадикальної патології, пригнічує клітинний і гуморальний імунітет, здійснює мутагенні, гонадотоксичні та ембріотоксичні ефекти [2–4]. Це повного мірою стосується нових хімічних сполук, зокрема органічного синтезу олігоефірів на основі двох і трьохатомних спиртів.
Актуальність проблеми вивчення цих хімічних речовин обумовлена великими обсягами виробництва, широким асортиментом продукції на їхній основі та відсутністю прогностичної характеристики потенційної небезпеки для людини. Саме це і визначає необхідність вивчення механізмів біологічної дії та патофізіологічних основ формування структурно-метаболічних порушень в організмі при тривалому впливі цих нових марок олігоефірів. У зв'язку з вищенаведеним, метою роботи є дослідження загальної токсичності та впливу на організм теплокровних тварин субтоксичних доз олігоефірів: Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80 та вивчення структурно-метаболічного стану печінки та її детоксикаційної функції.
Матеріали та методи дослідження. У роботі були використані олігоефіри на основі етиленгліколю і гліцерилу, які мають товарну назву «Лапроли» марок: Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. «Лапрол» 3603-2-12 (поліоксипропіленоксіетилентріол) — прозора, в'язка рідина, добре розчинна у воді, бензолі, толуолі, спиртах, має молекулярну масу 3600, питома щільність при 25°С — 1,03 г/см3. «Лапрол» Л-10002-2-80 (поліоксіетиленоксипропілендіол) — прозора, в'язка рідина, добре розчинна у воді та органічних розчинниках, молекулярної маси 10000, питома щільність при 25°С — 1,1 г/см3.
Програма дослідження передбачала проведення підгострого токсикологічного експерименту на білих щурах і вивчення впливу олігоефірів на показники структурно-метаболічного стану печінки і функцію детоксикації. Статевозрілі шури популяції WAG масою 190–200 г піддавалися щоденному пероральному впливу ксенобіотиків протягом 45 діб. Для цього водні розчини олігоефірів у дозах 1/10, 1/100 і 1/1000 ЛД50 вранці натщесерце за допомогою металевого зонду вводились внутрішньошлунково. Контрольна група тварин отримувала відповідні об'єми питної води. За результатами гострого токсикологічного експерименту Л-3603-2-12 відноситься до помірнотоксичних, а Л-10002-2-80 — до малотоксичних сполук, відповідно 3-й та 4-й клас безпеки. Середньолетальні дози ЛД50 були визначені для щурів на рівні 3,34 і 38,4 г/кг маси тварин відповідно для Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Коефіцієнти кумуляції (Кк) знаходилися на рівні 10,9 і 6,14 для Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Всі етапи наукового експерименту виконувалися відповідно до правил гуманного ставлення до тварин і вимог «Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, що застосовуються в науковому експерименті» — Страсбург, 1986.
Вивчення детоксикаційної функції печінки проводилося за наступними показниками: оцінка активності сульфатної, глутатіонової, глюкуронідної та ацетильної кон’югацій, стану системи оксидатно-антиоксидатної взаємодії і динамічних порушень білкового, вуглеводного, нуклеїнового і жирового обміну.
У зв'язку з поставленими завданнями вміст кетонових тіл у крові щурів визначали шляхом зв'язування ацетону саліциловим методом [5]. Неестерифіковані вільні жирні кислоти в плазмі крові визначали за екстракцією мідних солей жирних кислот органічними розчинниками [5]. Глікоген у печінці визначався методом Зейфтера [6]. Активність УДФ-глюкуронілтрансферази мікросомальної фракції печінки оцінювалася за швидкістю кон’югації паранітрофенолу [7, 8], N-ацетилтрансферази в постмітохондріальній фракції — за швидкістю кон’югації параамінобензойної кислоти, кількість якої вимірювали за реакцією діазосполучення з N-нафтамінетилендіаміном [91. Активність глутатіон-S-трансферази оцінювалася за утворенням кон’югатів глутатіону з 1-хлор-2,4-динітробензолом [10, 11]. Сумарний вміст КоА визначали методом ацетилювання параамінобензойної кислоти [11]. Вміст відновленого і окисленого глутатіону визначали в глутатіон-трансферазній реакції [12]. Цистеїн — за реакцією з нінгідрином у трихлороцтовому фільтраті [13]. Сумарну РНК виділяли фенольно-термічним методом [14]. Ядра із гепатоцитів виділяли за методом D.M. Gill [15], глобуліни — за методом Б.І. Збарського і Г.П. Георгієва [16], пістони — за методом E.W. Johns, A.V. Butter [17]. Про відносний рівень вторинних продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) робили висновок за накопиченням малонового діальдегіду (МДА), який визначали по Ю.А. Володимирову і О.І. Арчакову [18]. Дієнові кон’югати визначали спектрофотометричним методом [19]. Глюкозу, холестерин, креатинін, сечовину, аспарагінову (АСАТ) і аланінову амінотрансферази (АСАТ), триптофан-2,3-діоксигеназу визначали загальноприйнятими методами [6, 7]. Активність глюкозо-6-фосфатази (Г-6-Фаза) визначалась в печінці за методом, описаним А.А. Покровським і О.I. Арчаковим [20]. Для статистичної оцінки групових відмінностей використовувався параметричний t-критерій Стьюдента-Фішера.
Результати дослідження та їх обговорення. За результатами досліджень Л-3603-2-12 в 1/10 ДЛ50 знижував активність у мікросомах гепатоцитів УДФ-глюкуронілтрансферази і вміст загальних, зв язаних і вільних глюкуронідів (табл. 1). У цій дозі ксенобіотик пригнічував активність арилсульфаттрансферази в постмітохондріальній фракції і вміст у печінці загальних і зв'язаних сульфатів на фоні збільшення вільних сульфатів. N-ацетилтрансферазна активність у постмітохондріальній фракції знижувалася і знижувався загальний вміст у тканині печінки КоА. Активність глутатіон-S-трансферази в постмітохондріальній фракції гепатоцитів знижувалася на фоні підвищення в печінці окисленого і зменшення відновленого глутатіону. Сірковмісна амінокислота за цієї дози зменшувалася в тканині печінки. Динамічні зміни оціночних показників під впливом 1/100 ЛД50 мали в більшості випадків протилежну спрямованість. Вони характеризувалися підвищенням активності УДФ-глюкуронілтрансферази, арилсульфаттрансферази, N-апетилтрансферази, глутатіон-8-трансферази. Ці зміни супроводжувалися зростанням загальних, зв язаних і вільних глюкуронідів і сульфатів.
Таблиця 1. Вплив поліоксипропіленоксіетилентріолу Л-3603-2-12 на детоксикаційну функцію печінки в підгострому експерименті
Результати, які наведено в табл. 1, свідчать, що Л-3603-2-12 у дозі 1/100 ЛД50 підвищує вміст КоА в печінці на 135,98, відновленого глутатіону на 37,32%, окисленого глутатіону на 78,12% і цистеїну на 60,71%. Аналіз оціночних показників детоксикаційної функції печінки свідчить про те, що тривала субтоксична дія ксенобіотика має виразну дозову залежність: в 1/10 ЛД50 «Лапрол» Л-3603-2-12 пригнічує детоксикаційну функцію печінки, в 1/100 ЛД50 ксенобіотик навпаки суттєво активує ці процеси, що необхідно розглядати як захисно-пристосувальну реакцію організму на ушкоджуючу дію. В 1/1000 ЛД50 Л-3603-2-12 не впливає на детоксикаційну функцію печінки.
Дослідження детоксикаційної функції печінки під впливом Л-10002-2-80 виявили пригнічення фази кон’югації у групи щурів, токсифікованих 1/10 ЛД50, і підвищення функціональної активності печінки за тривалої субтоксичної дії 1/100 ЛД50. В 1/1000 ЛД50 олігоефір не впливав на структурно-метаболічні процеси, які пов’язані з механізмами знешкодження ксенобіотика (табл. 2).
Вплив Л-10002-2-80 у підгострому експерименті на детоксикаційну функцію печінки
Проте слід відзначити, шо Л-10002-2-80 у порівнянні з впливом Л-3603-2-12 менше пригнічував активність ферментів УДФ-глюкуронілтрансферази, арилсульфотрансферази, N-ацетилтрансферази і глутатіонтрансферази під впливом 1/10 ЛД50. Але в дозі 1/100 ЛД50активність Л-10002-2-80 була значно вища порівняно з Л-3603-2-12. З досвіду багатьох вчених з метою обґрунтування механізмів біологічної дії ксенобіотиків найбільш виправданим і раціональним є використання речовин у дозі 1/100 ЛД50, тобто тієї дози, яка викликає значні структурно-метаболічні порушення при тривалій токсифікації. Ця доза і була нами використана під час дослідження впливу ксенобіотиків на метаболічні процеси в печінці в умовах підгострого експерименту. Оцінка впливу олігоефірів на структурно-метаболічні процеси в печінці виявила підвищення вмісту малонового діальдегіду (МДА) і дієнів у гомогенатах цього органа, креатиніну і сечовини в сироватці і крові на фоні значного зниження глікогену (табл. 3). Так, вміст МДА підвищувався на 104,37% і 79,23%, дієнові кон’югати — на 68,34% і 48,72%, креатинін на — 67,34% і 49,71%, сечовина — на 150,0% і 100,58%, а вміст глікогену знижувався на 81,82% і 73,35%, відповідно під впливом Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Дослідження в печінці РНК, глобулінів і пістонів виявили суттєве зниження їх вмісту у порівнянні з групою контрольних тварин: РНК знижувалася на 53,68% і 41,75%, глобуліни — на 37,36% і 29,23%, пістони — на 42,69% і 34,87%, відповідно під впливом Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Вміст вільних жирних кислот і кетонових тіл у сироватці крові зростали: жирні кислоти — на 158,46% і 106,15%, кетонові тіла — на 532,35% і 423,52% відповідно у груп тварин токсифікованих Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Вміст глюкози в крові знижувався на 52,94% і 45,87 під впливом Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80.
Таблиця 3. Вплив ксенобіотикдв у дозі 1/100 ЛД50 на структурно-метаболічні процеси в печінці в умовах тривалої субтоксичної дії (М±m)
Одержані результати добре узгоджуються з динамікою активності глюкозо-6-фосфатази, вміст якої знижувався на 74,0% і 62,11% відповідно при токсифікації Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80. Вміст холестерину в сироватці крові підвищувався на 108,4% і 94,36% під впливом Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80.
Дослідження активності органоспецифічних ферментів виявили підвищення в печінці АЛАТ, АCАТ і зниження Т-2,3-ДО: АЛАТ підвищувалась на 398,24% і 326,31%, АСАТ на 411,11% і 338,88%, тоді як триптофандіоксигеназа знижувалася на 61,32% і 49,76%, відповідно у груп токсифікованих Л-3603-2-12 і JI-10002-2-80.
Висновок. За результатами проведених досліджень можна зробити висновок, що олігоефіри в дозі 1/10 ЛД50 викликають в організмі теплокровних значні структурно-метаболічні порушення в печінці, які поєднані з її дeтоксикаційною функцією. В дозі 1/100 ЛД50ксенобіотики призводили до активації метаболічних процесів і функції детоксикації. В дозі 1/1000 ЛД50 олігоефіри не впливали на метаболічну активність і детоксикаційну функцію печінки. Аналіз оціночних показників свідчить, що тривала дія Л-3603-2-12 і Л-10002-2-80 стимулює в організмі дослідних тварин вільнорадикальні процеси, перекисне окислення ліпідів призводить до виснаження антиоксидантної системи і порушень білкового, вуглеводного, ліпідного і нуклеїнового обміну, які в комплексі здатні формувати вільнорадикальну мембранну патологію, яка є провідним ланцюгом розвитку дистрофічних процесів у печінці та пригніченні детоксикаційної функції.
ЛІТЕРАТУРА
1. Биохимические механизмы радиомиметических эффектов поверхностно-активных веществ / Н.Г. Щербань. В.И. Жуков, В.В. Мясоедов [и др.] — Харьков: «Раритеты Украины», 2012. — 120 с.
2. Простые и макроцикличсскис эфиры: научные основы охраны водных объектов / В.И. Жуков, Л.Д. Попова, О.В. Зайцева [и др.] — Харьков: «Торнадо», 2000. — 438 с.
3. Медико-биологические аспекты проблемы охраны водных объектов от загрязнения поверхностно-активными веществами / В.И. Жуков, Р.И. Кратенко, Ю.К. Резуненко [и др.] — Харьков: «Торнадо», 2000. — 394 с.
4. Детергенты — модуляторы радиомиметических эффектов / В.И. Жуков, В.В. Мясоедов, Ю.И. Козин [и др.] — Белгород, 2000. — 376 с.
5. Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике / А.А. Покровский. — М: Медицина, 1969. — 652с.
6. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / под ред. проф. В.В. Меншикова. — М: Медицина, 1987. — 368 с.
7. Асатини В.С. Биохимическая фотометрия / B.C. Асатини. — М: Издательство академии наук СССР, 1957. — 836 с.
8. Burcliell В. 4-Nitrophenol UDP-glucoronyltransferase / В. Burcliell. P. Weatheril // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 169–171.
9. Weber W.W. N-acetyltransferese and Aiylhydroxamic Acid acyltransferese / W.W. Weber, G.M. King // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 272–281.
10. Habig W.H. Assays for differentiations of glutatlwne-S-transferase / W.H. Habig, W.B. Jacobi // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 398–405.
11. Экспериментальная витаминология / под ред. Ю.М. Островского. — Минск: Наука и техника, 1979. — 550 с.
12. Asaoka К. An enzymatic assay of reduced glutatione using glutatione-S-arvltransferase with O-dinitrobenzene as a substrate / K. Asaoka, K. Takashi // J. Biochem. — 1981. — V. 90, №5. — P. 1237–1242.
13. Gaitоnde M.K. A spectrophotometric method for direkt determination of cystcinc, m the prcscncc of other naturally occuring aminoacid / M.K. Caitonde // J. Biochem. — 1967. —V. 104, №2. — P. 627–633.
14. Георгиев Г.П. Информационная и рибосомалвная рибонуклеиновые кислоты хромосомно-ядрышкового аппарата, методы разделения и нуклеиновый состав / Г.П. Георгиев, В.П. Мантьева // Биохимия. — 1962. — Т. 27. — С. 949–957.
15. Gill D.M. An improved method for isolation of rat liver nuclei bv dengity centrifugation / D.M. Gill // J. Cell. Biology. — 1965. — V. 24. — P. 157–161.
16. Збарский Б.И. Новые данные по функционированию клеточных ядер печени крыс и химическому составу ядерных структур / Б.И. Збарский, Г.П. Георгиев // Биохимия. — 1959. — Т. 24., Вып. 2. — С. 192–199.
17. Jong Е.V. Father fractionarmg of histones from calf thymus / E.V. Jong, A.V. Butter // Biochemical J. — 1962. — V. 82. №1. — P. 15–18.
18. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. — М: Медицина, 1972. — 236 с.
19. Косухин А.Б. Экстракция липидов смесью гептан-изопропанол для определения диеновых конъюгатов / А.Б. Kocvxин, Б.С. Ахметова // Лаб. дело. — 1987. — №5. — С. 335–337.
20. Покровский А.А, Методы разделения и ферментной идентификации субклеточных фракций / А.А. Покровский, А.И. Арчаков. Современные методы в биохимии. — М: Медицина, 1968. — С. 5–59.
REFERENCES
1. Biokhimicheskie mekhanizmy radiomimeticheskikh effektov poverkhnostno-aktivnykh veschestv / N.G. Scherban'. V.I. Zhukov, V.V. Myasoedov [i dr.] — Khar'kov: «Raritety Ukrainy», 2012. — 120 s.
2. Prostye i makrociklichsskis efiry: nauchnye osnovy okhrany vodnykh ob'ektov / V.I. Zhukov, L.D. Popova, O.V. Zajceva [i dr.] — Khar'kov: «Tornado», 2000. — 438 s.
3. Mediko-biologicheskie aspekty problemy okhrany vodnykh ob'ektov ot zagryazneniya poverkhnostno-aktivnymi veschestvami / V.I. Zhukov, R.I. Kratenko, Yu.K. Rezunenko [i dr.] — Khar'kov: «Tornado», 2000. — 394 s.
4. Detergenty — modulyatory radiomimeticheskikh effektov / V.I. Zhukov, V.V. Myasoedov, Yu.I. Kozin [i dr.] — Belgorod, 2000. — 376 s.
5. Pokrovskij A.A. Biokhimicheskie metody issledovaniya v klinike / A.A. Pokrovskij. — M: Medicina, 1969. — 652s.
6. Laboratornye metody issledovaniya v klinike. Spravochnik / pod red. prof. V.V. Menshikova. — M: Medicina, 1987. — 368 s.
7. Asatini V.S. Biokhimicheskaya fotometriya / B.C. Asatini. — M: Izdatel'stvo akademii nauk SSSR, 1957. — 836 s.
8. Burcliell В. 4-Nitrophenol UDP-glucoronyltransferase / В. Burcliell. P. Weatheril // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 169–171.
9. Weber W.W. N-acetyltransferese and Aiylhydroxamic Acid acyltransferese / W.W. Weber, G.M. King // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 272–281.
10. Habig W.H. Assays for differentiations of glutatlwne-S-transferase / W.H. Habig, W.B. Jacobi // Meth. Enzymol. — 1981. — V. 77. — P. 398–405.
11. Eksperimental'naya vitaminologiya / pod red. Yu.M. Ostrovskogo. — Minsk: Nauka i tekhnika, 1979. — 550 s.
12. Asaoka К. An enzymatic assay of reduced glutatione using glutatione-S-arvltransferase with O-dinitrobenzene as a substrate / K. Asaoka, K. Takashi // J. Biochem. — 1981. — V. 90, №5. — P. 1237–1242.
13. Gaitоnde M.K. A spectrophotometric method for direkt determination of cystcinc, m the prcscncc of other naturally occuring aminoacid / M.K. Caitonde // J. Biochem. — 1967. —V. 104, №2. — P. 627–633.
14. Georgiev G.P. Informacionnaya i ribosomalvnaya ribonukleinovye kisloty khromosomno-yadryshkovogo apparata, metody razdeleniya i nukleinovyj sostav / G.P. Georgiev, V.P. Mant'eva // Biokhimiya. — 1962. — T. 27. — S. 949–957.
15. Gill D.M. An improved method for isolation of rat liver nuclei bv dengity centrifugation / D.M. Gill // J. Cell. Biology. — 1965. — V. 24. — P. 157–161.
16. Zbarskij B.I. Novye dannye po funkcionirovaniyu kletochnykh yader pecheni krys i khimicheskomu sostavu yadernykh struktur / B.I. Zbarskij, G.P. Georgiev // Biokhimiya. — 1959. — T. 24., Vyp. 2. — S. 192–199.
17. Jong Е.V. Father fractionarmg of histones from calf thymus / E.V. Jong, A.V. Butter // Biochemical J. — 1962. — V. 82. №1. — P. 15–18.
18. Vladimirov Yu.A. Perekisnoe okislenie lipidov v biologicheskikh membranakh / Yu.A. Vladimirov, A.I. Archakov. — M: Medicina, 1972. — 236 s.
19. Kosukhin A.B. Ekstrakciya lipidov smes'yu geptan-izopropanol dlya opredeleniya dienovykh kon'yugatov / A.B. Kocvxin, B.S. Akhmetova // Lab. delo. — 1987. — №5. — S. 335–337.
20. Pokrovskij A.A, Metody razdeleniya i fermentnoj identifikacii subkletochnykh frakcij / A.A. Pokrovskij, A.I. Archakov. Sovremennye metody v biokhimii. — M: Medicina, 1968. — S. 5–59.
Надійшла до друку 4.09.2015 p.