Study of Metallothioneins Induction in the Mice Liver After Intraperitoneal Injection of Divalent Metals Salts

  • Authors: E.G. Pikhteyeva
  • UDC: 612.014.4
Download attachments:

Е.Г.Пыхтеева

Украинский НИИ медицины транспорта, г. Одесса

SUMMARY. The induction of metallothioneins in the liver of mice after a single intraperitoneal introduction of divalent heavy metals salts was studied (ZnCl2, Cd(СН3СОО)2, Pb(СН3СОО)2*3H2O, Hg(СН3СОО)2, CuCl2). The cadmium chloride is the most potent metallothionein inducer. The content of metallothionein in the liver increased by an average of 33 times compared with the control.
Key words: metallothionein, liver, heavy metals, intraperitoneal injection.

Металлотионеины (МТН) в настоящее время рассматриваются как суперсемейство низкомолекулярных белков. Они присутствуют практически во всех живых организмах [1] и ответственны за обеспечение биодоступности цинка и детоксикацию некоторых токсичных металлов. Типичной особенностью их строения является отсутствие ароматических аминокислот и высокое содержание остатков цистеина, что определяет способность МТН к связыванию ионов одно- и двухвалентных металлов, снижение содержания реактивных форм кислорода и оксидов азота [2].

Непосредственно вслед за открытием роли МТН в транспорте металлов началось интенсивное изучение возможности и эффективности использования показателя индукции этого белка в тканях и биосредах как высокочувствительного маркера профессиональных и экологически обусловленных интоксикаций тяжелыми металлами, вероятного активного участника в патогенезе отравлений, показателя соотношения повреждающих и защитных механизмов для прогноза вероятных исходов поражений, поиска средств и способов дезинтоксикационных мероприятий.

Известно, что синтез MTН in vivo и in vitro индуцируется различными факторами, например, тяжелыми металлами [3], четыреххлористым углеродом [4], оксидативным стрессом, химиотерапевтическими противораковыми средствами, курением и продолжительным голоданием [8]. M. Penkowa с соавт. [5] описали индукцию синтеза МТН в скелетных мышцах при повышенной физической нагрузке.

Наиболее мощными индукторами МТН являются катионы тяжелых металлов (ТМ). Например, кадмий и цинк способны повышать уровень МТН в печени до 100 раз. Другие ТМ, включая Au, Bi, Cu, Co, Hg, Fe, In, Mn, Ni, Pt, — также способны индуцировать рост МТН в различной степени в зависимости от концентрации и способа введения металла, режима питания и некоторых других факторов, а также вида ткани и ее физиологического статуса. Степень индукции также зависит от времени после введения, так как для транспорта металла к месту синтеза, экспрессии генов мРНК МТН и собственно синтеза белка требуется определенное время. Физические стрессоры также повышают уровень синтеза МТН в 5-10 раз, воспалительные агенты (например, ЛПС) или провоспалительные цитокины стимулируют экспрессию МТН в печени в 10-20 раз. Важно подчеркнуть, что, во-первых, этот эффект прослеживается в опытах in vitro и in vivo, во-вторых, индукция МТН ионами ТМ имеет выраженную тканевую и изоформную специфичность [6].

Цинк и медь являются физиологическими индукторами МТН. Другие индукторы активны в большей или меньшей степени как стресс-агенты. Именно наличие цинка в МТН позволяет этим белкам играть ключевую роль в клеточном окислительно-восстановительном метаболизме и взаимодействовать с физиологически релевантными молекулами за счет динамичных Zn-тиолатных связей [7]. Раскрытие данного взаимодействия обусловило прогресс в изучении механизмов выполнения МТН своих физиологических функций по клеточному транспорту Zn, выработке энергии клетками, защите организма от оксидативного стресса и нейродегенеративных заболеваний.

Упрощенная схема поведения металла-индуктора МТН представлена на схеме (рис.1). При введении металла, независимо от способа введения, моментально происходит его комплексообразование с белками или другими комплексообразователями. Не случайно, в живом организме ТМ не существуют в виде свободных ионов. Затем происходит всасывание комплексов в кровь и неспецифическое связывание с белками крови, в основном, с альбумином. Металлальбуминовый комплекс транспортируется в печень, где происходит перекомплексообразование с более сильным акцептором — МТН. В гепатоцитах, также как и в других клетках организма, часть МТН находится в неполностью металлизированном состоянии [7] и доступна для связывания. Поступление комплекса металла в клетку вызывает Zn-зависимую экспрессию гена мРНК МТН и индукцию синтеза МТН с протеканием целого каскада промежуточных реакций с участием множества сигнальных и управляющих молекул, в т.ч. факторов транскрипции и цинксодержащих пальцевидных белков.

Рис 1. Транспорт и выведение металлов — индукторов МТН.

Связанный с токсичными ТМ комплекс МТН распознается организмом как подлежащий утилизации и выведению, транспортируется в лизосомы, где и происходит его биодеградация. Продукты биодеградации (низкомолекулярные водорастворимые комплексы ТМ) выводятся из клетки путем экзоцитоза. При превышении физиологической емкости лизосом из-за высокой концентрации ТМ происходит повреждение клеток.

Понимание механизмов индукции МТН соединениями тяжелых металлов при разных способах введения дало бы возможность использовать содержание МТН в органах и тканях в диагностических и прогностических целях.

В большинстве проведенных в мире работ по изучению индукции МТН исследователи используют внутрижелудочный способ введения соединений ТМ [8]. Практически не изучена индукция МТН при внутривенном и интраперитонеальном введении.

Материалы и методы

Исследование проведено на нелинейных белых лабораторных мышах-самцах (т.н. "мышах дикого типа") массой 18-25 г. Животные были разделены на 6 групп по 5 мышей в каждой. І группа служила контролем. Животным ІІ, ІІІ, IV, V, VI групп внутрибрюшинно вводили растворимые соли свинца, меди, цинка, ртути, кадмия соответственно (в дозе 1/20 от LD50).

Каждому животному вводили (в зависимости от массы) 0,4-0,5 мл раствора соли соответствующего металла (вводимая доза составляла 1/20 LD50). Через 3 суток животных выводили из эксперимента декапитированием под эфирным наркозом с соблюдением требований биоэтики. В печени определяли содержание металлов методом атомно-эмиссионной спектроскопии на атомно-эмиссионном спектрометре ЭМАС-200 CD с электродуговой атомизацией и МТН по методу, описанному в [9].

Результаты и их обсуждение

Внутрибрюшинный способ введения солей ТМ является традиционным при исследовании токсикометрических показателей, и изучение индукции МТН при этом способе введения представляет определенный интерес. Значения LD50 исследуемых солей металлов (табл. 1) взяты из базы данных MSDS (http://www.strem.com). Измерения приведенных LD50 проведены в ведущих лабораториях мира с выполнением всех правил GLP.

Таблица 1

Значения LD50 для мышей при внутрибрюшинном введении

Как видно из анализа табл. 1, при внутрибрюшинном введении для мышей наименее токсичным является ацетат свинца, который менее токсичен, чем соли цинка и меди. Молярный ряд токсичности для изученных соединений имеет следующий вид: Hg2+>Cd2+> Cu2+> Zn2+> Pb2+ Поскольку для индукции МТН однократно вводили дозу 1/20 LD50, на одну мышь было ведено в среднем количество соли (в пересчете на металл), приведенное в табл. 2.

Таблица 2

Количество (мкг) соли и иона металлов, введенное в среднем на 1 животное массой 20 г

Несмотря на столь небольшое количество введенных солей, в печени подопытных животных наблюдался достоверный рост концентрации соответствующих металлов, кроме меди, рост концентрации которой в печени недостоверен, что объясняется ее высоким базальным содержанием в печени, по сравнению с которым введенная доза несущественна (рис. 1).

Рис.1. Среднее содержание меди в печени мышей после однократной внутрибрюшинной экспозиции солями тяжелых металлов в дозе 1/20 LD50

При этом интересно отметить, что достоверный рост содержания цинка в печени по отношению к контролю (рис. 2) наблюдается не только у животных, которым вводили хлорид цинка, но и у мышей, которым вводили соли свинца, ртути и меди, что согласуется с мобилизацией цинка в печень в связи с его повышенной потребностью для индукции МТН именно в печени, где его синтез максимален.

Рис. 2. Среднее содержание цинка в печени мышей после однократной внутрибрюшинной экспозиции солями тяжелых металлов в дозе 1/20 LD50

Установлено, что экспрессия генов мРНК МТН, предшествующая собственно белковому синтезу, инициируется только биодоступными ионами цинка, которые вытесняются из МТН при наличии в печени повышенных концентраций токсичных двухвалентных ионов, связывание которых с сульфгидрильными группами МТН носит более прочный характер [8].

Содержание МТН в печени определяли методом насыщения кадмием с его детекцией методом АЭС-ДА. При этом возникли трудности с определением МТН в группе, экспонированной солью ртути. После определения по стандартной методике были получены явно заниженные значения. Поскольку общеизвестно, что ртуть является мощным индуктором МТН [8], был проведен дополнительный анализ. Известно, что заместительный метод основан на вытеснении кадмием цинка и других металлов из МТН в условиях in vitro с последующим удалением избытка кадмия и аналитическим измерением содержания кадмия, стехиометрично связанного с МТН. Однако, в силу своих химических свойств ион кадмия не может вытеснить из МТН ионы ртути, так как связь последних с сульфгидрильными группами МТН значительно прочнее. Поэтому после удаления избытка кадмия раствор, содержащий Сd, Hg-МТН был подвергнут "мокрому" озолению в среде азотной кислоты, после чего в нем было определено молярное содержание ртути, которая осталась связанной и не была вытеснена из МТН. Таким образом, было показано, что при индукции соединениями ртути примерно треть мест связывания металлов в МТН занята ионами ртути, остальная — ионами цинка и меди. Средние концентрации МТН в печени мышей разных групп приведены на рис. 3.

Рис. 3. Среднее содержание МТН (нмоль/г) в печени мышей разных групп после однократной внутрибрюшинной экспозиции солями тяжелых металлов в дозе 1/20 LD50

Полученные данные свидетельствуют о том, что в дозе 1/20 LD50 наиболее сильную индукцию МТН вызывает ацетат кадмия. Достаточно высокая индукция МТН ацетатом свинца может быть объяснена его более высокой введенной дозой (см. табл. 2). По степени индукции ионы металлов расположились в следующей последовательности: Cd2+> Pb2+> Zn2+> Hg2+>Cu2+

Для более корректного построения ряда ионов металлов по их способности индуцировать МТН в печени запланирован эксперимент, в котором будет вводиться одинаковая молярная доза металла, соответствующая1/2 LD50 наиболее токсичного соединения.

Выводы
1. Все изученные соединения ТМ являются индукторами МТН.
2. Даже низкие дозы Cd2+ (1/20 LD50 или 6,8 мкг на мышь) при однократном внутрибрюшинном введении вызывают рост МТН в 33 раза, т.е. МТН является очень чувствительным биомаркером экспозиции кадмием.

ЛИТЕРАТУРА

1. Tang C.-M. trans Repression of the Human Metallothionein IIA. Gene Promoter by PZ120, a Novel 120-Kilodalton Zinc Finger Protein / C. — M. Tang, J.Westling, E. Seto // Molecular and Cellular Biology — 1999. — Vol. 19, No. 1. — P. 680 — 689.

2. Karin M.. Characterization of the metallothioneins induced in HeLa cells by dexamethasone and zinc. / M. Karin, H. R. Herschman. //Eur. J. Biochem. — 1980. — Vol. 107 — P. 395 — 401.

3. Metallothionein-null mice are more sensitive than wild-type mice to liver injury induced by repeated exposure to cadmium. / S. S. Habeebu, J. Liu, Y. Liu [et al.] // Toxicol. Sci. — 2000.-Vol. 55 — Р.223 — 232.

4. Induction of metallothionein in the liver of carbon tetrachloride intoxicated rats — Р. an immunohistochemical study / S.E.Theocharis, A.P.Margeli, S.D.Skaltsas [et al.] // Toxicology. — 2001. — Vol. 161, № 1—2 — P. 129 — 138.

5. Exercise-induced metallothionein expression in human skeletal muscle fibres / M. Penkowa, P. Keller, C. Keller [et al.] // Exp. Physiol. — 2005. — Vol.90(4) — Р. 477 — 486.

6. Sasagawa S. Stress-related induction of hepatic metalloth-ionein synthesis and increase in peripheral polymorphonuclear leukocytes in mice. / S. Sasagawa, J. Matsubara , Y. Satow // Immunopharmacol Immunotoxicol. — 1993 — Vol. 15 (2- 3) — Р. 217 — 226.

7. Bell S.G. The metallothionein/thionein system: an oxidore-ductive metabolic zinc link /S. G. Bell, B. L. Vallee // Chembiochem. — 2009. — Vol. 10, N 1. — P. 55 — 62.

8. Шафран Л. М. Металлотионеины / Л. М. Шафран, Е. Г. Пыхтеева, Д. В. Большой — Под редакцией проф. Л.М. Шафрана — Одесса: Издательство "Чорномор'я", 2011. — 428 с.

9. Пыхтеева Е. Г. Сравнение методов количественного определения металлотионеина с атомно-абсорбционной и атомно-эмиссионной детекцией. / Е. Г. Пыхтеева, Д.В. Большой // Здоровье и окружающая среда. Сборник научных трудов. — Минск — 2011 — Выпуск 17. — С. 191 — 194.

 

REFERENCES

1. Tang C.-M. trans Repression of the Human Metallothionein IIA. Gene Promoter by PZ120, a Novel 120-Kilodalton Zinc Finger Protein / C. — M. Tang, J.Westling, E. Seto // Molecular and Cellular Biology — 1999. — Vol. 19, No. 1. — P. 680 — 689.

2. Karin M.. Characterization of the metallothioneins induced in HeLa cells by dexamethasone and zinc. / M. Karin, H. R. Herschman. //Eur. J. Biochem. — 1980. — Vol. 107 — P. 395 — 401.

3. Metallothionein-null mice are more sensitive than wild-type mice to liver injury induced by repeated exposure to cadmium. / S. S. Habeebu, J. Liu, Y. Liu [et al.] // Toxicol. Sci. — 2000.-Vol. 55 — Р.223 — 232.

4. Induction of metallothionein in the liver of carbon tetrachloride intoxicated rats — Р. an immunohistochemical study / S.E.Theocharis, A.P.Margeli, S.D.Skaltsas [et al.] // Toxicology. — 2001. — Vol. 161, № 1—2 — P. 129 — 138.

5. Exercise-induced metallothionein expression in human skeletal muscle fibres / M. Penkowa, P. Keller, C. Keller [et al.] // Exp. Physiol. — 2005. — Vol.90(4) — Р. 477 — 486.

6. Sasagawa S. Stress-related induction of hepatic metalloth-ionein synthesis and increase in peripheral polymorphonuclear leukocytes in mice. / S. Sasagawa, J. Matsubara , Y. Satow // Immunopharmacol Immunotoxicol. — 1993 — Vol. 15 (2- 3) — Р. 217 — 226.

7. Bell S.G. The metallothionein/thionein system: an oxidore-ductive metabolic zinc link /S. G. Bell, B. L. Vallee // Chembiochem. — 2009. — Vol. 10, N 1. — P. 55 — 62.

8. Shafran L. M. Metallotioneiny / L. M. Shafran, E. G. Pykhteeva, D. V. Bol'shoj — Pod redakciej prof. L.M. Shafrana — Odessa: Izdatel'stvo "Chornomor'ya", 2011. — 428 s.

9. Pykhteeva E. G. Sravnenie metodov kolichestvennogo opredeleniya metallotioneina s atomno-absorbcionnoj i atomno-emissionnoj detekciej. / E. G. Pykhteeva, D.V. Bol'shoj // Zdorov'e i okruzhayuschaya sreda. Sbornik nauchnykh trudov. — Minsk — 2011 — Vypusk 17. — S. 191 — 194.

 

Надійшла до редакції 16.01.2011