Активація сигнальних механізмів, які забезпечують виживання пухлинних клітин у відповідь на дію стресових чинників, може бути причиною обмеженої ефективності хіміо- та радіотерапії.
Важливе значення щодо аналізу проблеми стійкості пухлинних клітин до терапії мають дослідження, які проводяться на моделях експериментально одержаних резистентних клітинних ліній (селективний відбір клітинних суб-клонів під впливом терапевтичних агентів; внесення до клітин за допомогою вірусних векторів генів, відповідальних за виживання клітин у несприятливих умовах і т. п.) [1, 2]. Дослідження чутливості цих клітин до дії стресових чинників різної природи і змін, що виникають при цьому, а також з'ясування механізмів координованої регуляції різних захисних систем клітини, які можуть визначати перехресну резистентність пухлини до пошкодження, — необхідний етап передклінічних досліджень нових підходів, спрямованих на вибіркове й ефективне зниження стійкості ракових клітин до протипухлинної терапії in vivo [3].
Хронічна мієлогенна лейкемія характеризується порушеннями хромосомного набору, які виражаються в появі філадельфійської хромосоми: реципрокної транслокації довгих ланцюгів хромосом 9 і 22. І як наслідок — спостерігається конститутивна активація Bcr-Abl тирозинкінази, що, вірогідно, призводить до виникнення підвищеної стійкості клітин як до променевої терапії, так і до хіміотерапії, однак механізми такої резистентності вивчені недостатньо [4].
Метод ДНК-комет є одним з найбільш перспективних методів, який може бути використаний для оцінки пошкоджень ДНК та їх репарації, дослідження генотоксичності фармацевтичних препаратів і промислових хімічних речовин, візуалізації апоптичних клітин, оцінки схильності до онкологічних захворювань і реакції на проведену протипухлинну терапію та ін. [5-7].
Метою роботи було порівняння впливу генотоксичних чинників (іонізуюче випромінювання, перекис водню) на пошкодження ДНК та їхню репарацію у клітинах лінії К562 і субклонах клітин К562, одержаних після дії одноразового рентгенівського опромінення.
Матеріали та методи дослідження
Клітини лінії К562 (мієлогенна лейкемія людини) вирощували в середовищі RPMI 1640 ("Sigma", США), за присутності 10% декомплементованої ембріональної сироватки великої рогатої худоби (FCS, "Sigma", США) і 50 мкг/мл гентаміцину. Культивовані клітини підтримували в зволоженій атмосфері з 5% СО2 при 37оС
Для опромінення клітин було використано рентгенівську установку Clinac 600 ("Varian", США) Потужність дози становила 1 Гр хв. Селективний відбір суб-клонів клітин лінії К562 здійснювали після одноразового опромінення в дозі 4 Гр .
Для оцінки пошкоджень ДНК, викликаних дією перекису водню, клітини обробляли 100 μМ Н2О2 протягом 1 хвилини у безсироватко-вому середовищі при 37°С, після чого їх осаджували центрифугуванням протягом 5 хвилин при 170 g та двічі промивали охолодженим за-буференим фізіологічним розчином (137 мМ NaCl, 2,7 мM KCl, 4,3 мМ Na2HPO4, 1,4 мМ KH2PO4, рН 7,4) із центрифугуванням за таких самих умов (5 хвилин, 170 g) для видалення залишкового Н2О2.
Інтенсивність росту клітинної культури та відсоток мертвих клітин визначали після їх фарбування розчином трипанового синього (кінцева концентрація 0,1%, час фарбування — 5 хв) та підрахунку зафарбованих (мертвих) і незафарбованих (живих) клітин під інвертованим мікроскопом у цитометричній камері Фукса-Розенталя
Для виявлення індукованих радіацією чи перекисом водню розривів ДНК та їх репарації використовували гель-електрофорез одиничних клітин (Single Cell Gel Electrophoresis Assay, SCGE) або метод ДНК-комет за умов лужного рН згідно загальноприйнятих методик [6, 8] та з деякими модифікаціями, як було нами описано раніше [9] У різні часові інтервали (0, 15, 30, 60, 120 та 180 хв) після дії іонізуючої радіації чи Н2О2, відбирали аліквоти суспензії клітин (2х104 у 50 мкл) для комет-аналізу. Комети зафарбовували розчином бромистого етидію (20 мкг мл), оглядали під флюоресцентним мікроскопом та класифікували на 5 категорій (A0 — A4) згідно з класифікацією, розробленою Коллінзом [6, 10] Для кожного експериментального зразка обробляли по 100 зображень комет. Середній рівень пошкоджень ДНК (D) в умовних одиницях (у.о.) визначали за формулою: D = A1 + 2хA2 + 3хA3 + 4хA4 [8, 11], де А1, А2, А3, А4 — кількість комет відповідних класів Таким чином, підрахований загальний рівень пошкоджень ДНК у зразку може коливатись від 0 (100% комет категорії A0) до 400 у.о. (100% комет категорії A4).
Варіаційно-статистичне опрацювання отриманих результатів проводили з використанням критерію Стьюдента за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Excel.
Результати дослідження та їх обговорення
Іонізуюче випромінювання викликає ряд пошкоджень ДНК, серед яких одно- та дво-ланцюгові розриви, пошкодження азотистих основ та залишків цукрів, виникнення між- та внутрішньониткових зшивок ДНК-ДНК та ДНК-білок, поява хромосомних аберацій Вважається, що опромінення змінює стан клітинних захисних механізмів: систем антиоксидантного захисту, репарації ДНК, регуляції клітинного циклу і апоптозу [12]. Дія іонізуючої радіації може спричиняти як виникнення ефекту зниження чутливості клітин до наступного опромінення (адаптивна відповідь), так і підвищення радіочутливості (гіперчутливість до опромінення) [13, 14]. У формуванні ефектів опромінення беруть участь різні сигнальні шляхи, в які залучена низка білків, зокрема PARP, р53, протеїнкінази (c-Abl, ATM), Rad1, Rad9, Rad17, Hus1 та ін. [15]. Однак, дотепер немає єдиної думки про те, на які клітинні пошкодження активуються системи клітинної відповіді на дію радіації.
У дослідах, в яких клітини К562 та суб-клони клітин К562, ізольовані після одноразового опромінення в дозі 4 Гр, піддавали дії рентгенівського опромінення (2,0 Гр), було встановлено зменшення приросту цих клітин порівняно з неопроміненими клітинами (рис. 1). Даний ефект залежав від часу, і його величина зростала зі збільшенням тривалості культивування клітин після припинення дії радіації. Так, культивування клітин К562 та суб-клонів цих клітин протягом 72 год після опромінення супроводжувалось пригніченням клітинного росту на 30-32% порівняно з контрольними (неопроміненими) клітинами Слід також зазначити, що суб-клони клітин К562 росли повільніше порівняно з батьківськими клітинами лінії К562 (рис. 1). Раніше нами було встановлено, що дія рентгенівського опромінення (2, 5, 10 Гр) призводила до дозоза-лежного інгібування росту клітин К562, що зумовлене, головним чином, пригніченням їхньої проліферативної активності, а не загибеллю [9].
Рис. 1. Вплив іонізуючого випромінювання на проліферацію клітин лінії К562 та суб-клонів клітин К562.
Серед пошкоджень ДНК, викликаних дією іонізуючого опромінення, особливу увагу дослідників привертають одно- та дволанцюгові розриви ДНК. Одноланцюгові розриви швидко репарують. Дволанцюгові розриви, не усунені в процесі репарації ДНК, призводять до цитогенетичних порушень і загибелі клітин. З іншого боку, неправильно репаровані розриви ДНК можуть спричиняти виникнення мутацій чи геномних перебудов у клітинах, які вижили [12].
Наступним кроком наших досліджень було перевірити: відмінності в чутливості потомків опромінених клітин до дії стресових чинників відбуваються завдяки запобіганню утворення розривів ДНК чи активізації процесів репарації ДНК. Дослідження пошкоджень і репарації ДНК проводили з використанням комет-аналізу. Даний метод дозволяє за допомогою гель-електрофорезу ізольованих клітин, ДНК яких зафарбована флюоресцентним барвником, отримувати зображення, що нагадують "голову" та "хвіст" комети. Інтенсивність флюоресценції "хвоста" комети, який утворюється в результаті міграції в гелі агарози пошкоджених або розплетених ділянок ДНК, відображає рівень пошкодження ДНК [7, 11].
Для того, щоб оцінити чутливість методу та його здатність розпізнавати різні типи ушкоджень ДНК, нами були використані генотоксичні агенти, що відрізняються за механізом дії (іонізуюче випромінювання, перекис водню).
Надлишкова активація реакцій вільнорадикального окиснення являє собою типовий патологічний процес, що має місце при найрізноманітніших захворюваннях і дії пошкоджуючих факторів на організм. Початковим етапом розвитку окиснювального стресу є надлишкове утворення активних форм кисню, таких як гідроксильний радикал, супероксид-аніон, перекис водню та синглетний кисень.
Причинами цього можуть бути як порушення функцій мітохондрій, так і пригнічення ендогенних антиоксидантних систем, що нейтралізують вільні радикали. Перекис водню спричиняє одно- та дволанцюгові розриви ДНК після перетворення на гідроксильний радикал через реакцію Фентона, хоча дія кальцій-залежних нуклеаз та пероксидаз ліпідів є також проявом генотоксичної дії перекису водню [16].
Встановлено, що у неопромінених клітинах лінії К562 та у суб-клонах К562 рівень ендогенних пошкоджень ДНК не перевищував 95 у.о. (табл. 1). У клітинах К562, які тестували відразу (0 хв) після опромінення, спостерігали, головним чином, появу 72±5% комет класу А2 (у комет цього класу кількість ДНК, яка знаходиться у "хвості" комети, становить менше 20%) та 25±3% комет класу А1 (містять менше 5% ДНК у "хвості"). Кількість комет класів А0 (немає пошкоджень ДНК), А3 (кількість ДНК у "хвості" становить від 20 до 75%) та А4 (більше 75% ДНК розміщується у "хвості" комети) за даних експериментальних умов становила менше 3%. Виявлено, що рівень початкових пошкоджень ДНК, викликаних дією іонізуючої радіації, у суб-клонів К562 був меншим, порівняно з рівнем пошкоджень ДНК у "батьківських" клітинах даної лінії (табл. 1).
Таблиця 1
Вплив рентгенівського випромінювання на індукцію пошкоджень ДНК та їхню репарацію у клітинах лінії К562 та суб-клонах К562
У клітинах лінії К562 та у суб-клонах цієї лінії, які тестували на різні терміни (0, 15, 30, 60, 120, 180 хв) після опромінення в дозі 2 Гр, репарація однониткових розривів ДНК найбільш інтенсивно здійснювалась протягом перших 30 хв після опромінення (табл. 1). Слід відзначити, що після 180 хв культивування опромінених клітин залишкові нерепаровані пошкодження були виявлені у "батьківських" клітинах лінії К562, тоді як у суб-клонів К562 на 180 хв після дії іонізуючої радіації не було виявлено достовірних змін у ступені пошкодження ДНК порівняно з неопроміненими клітинами цієї сублінії (табл. 1).
Як видно із таблиці 2, рівень початкових пошкоджень ДНК, викликаних дією Н2О2 у суб-клонів К562 менший, порівняно з рівнем пошкоджень ДНК у "батьківських" клітинах лінії К562. У суб-клонах К562, які тестували відразу (0 хв) після дії Н2О2, виявлені в основному комети класів А2 (88±4%) і А3 (10±0,5%), тоді як у клітинах К562 за даних експериментальних умов кількість комет класів А2 і А3 становила 54±5% і 37±2%, відповідно. Інкубація клітин К562 (протягом 3 годин при 37°С) після дії 100 μМ Н2О2 призводила до зменшення кількості ДНК у "хвостах" комет завдяки репарації ДНК, яка найбільш ефективно відбувалась протягом перших 15 хв після впливу Н2О2. Так, на 15 хв після культивування "батьківських" клітин лінії К562 виявлені комети класів А1 (74±1%) і А2 (15±5%), тоді як у суб-клонів К562 — А0 (20±4%) і А1 (73±5%). Повну репарацію пошкоджень ДНК у субклонах К562 спостерігали на 30 хв, а в "батьківських" клітинах К562 — на 60 хв після дії Н2О2 (табл. 2).
Таблиця 2
Вплив перекису водню на індукцію пошкоджень ДНК та їхню репарацію у клітинах лінії К562 та суб-клонах К562
Отже, селективну перевагу пухлинним клітинам забезпечує не тільки тимчасова активація їх захисних механізмів, індукована у відповідь на дію пошкоджуючого фактора (хімічної чи фізичної природи), але й інші властивості, такі як прискорене розмноження, зміна чутливості до факторів росту та ін. Індукція первинних змін, що викликають резистентність пухлин до дії пошкоджуючих факторів, відбувається як на молекулярному, так і на клітинному рівні та не виключає участі у подальшому змін на більш високих рівнях організації живої матерії (міжклітинні взаємодії, тканина, системи органів, організм) [3].
Завдяки високій чутливості модифікований лужний варіант методу ДНК-комет може бути використаний для оцінки генотоксичності лікарських засобів, при контролі результатів лікування та індивідуального підбору ДНК-тропних лікарських препаратів. У подальшій роботі планується дослідити експресію білків, що регулюють клітинний цикл та апоптоз у батьківських клітинах К562 та суб-клонах цих клітин, а також з'ясувати, протягом скількох поколінь в опромінених клітинах зберігається чутливість/резистентність до індукції одно- та дволанцюгових розривів ДНК.
Висновки
1. Результати наших досліджень in vitro з використанням комет-аналізу дозволяють визначати диференціальну чутливість до дії генотоксичних чинників як клітинних ліній, так й їхніх суб-клонів, одержаних після дії одноразового іонізуючого опромінення.
2. Відмінності в чутливості суб-клонів клітин К562 порівняно з "батьківськими" цієї лінії до дії іонізуючої радіації та перекису водню можуть бути спричинені відмінностями в ДНК-репаруючій здатності цих клітин: у суб-клонів клітин К562 виявлений нижчий рівень початкових пошкоджень ДНК під впливом досліджуваних стресових чинників та вища швидкість їхньої репарації.
3. Таким чином, навіть дія одноразового іонізуючого опромінення в дозі 4 Гр індукує виникнення епігенетичних змін у клітинах лінії К562, що може спричинити виникнення тимчасової резистентності суб-клонів цих клітин до дії радіації та перекису водню.
ЛІТЕРАТУРА
1. Alexandrova S.A. Genetic variability of the mouse hepatoma cells MH-22a revealed by RAPD-PCR-fingerprinting under different conditions of cultivation / S.A. Alexandrova, I.N. Shvemberger // Exp. Oncol. — 2005. — V. 27, № 2. — P. 114—119.
2. Svirnovski A. Attemts to influence the drug resistance of tumor cells in experimental system / A. Svirnovski, V. Pasiukov // Exp Oncol. — 2005. — V. 27, № 1. — P. 43—46.
3. Свирновский А.И. Молекулярные основы феномена хи-мио- и радиорезистентности при опухолевых процессах / А.И. Свирновский, В.В. Пасюков // Медицинские новости. — 2007. — № 11. — С. 7—19.
4. Goldman J.M. Chronic myeloid leukemia — advances in biology and new approaches to treatment / J.M. Goldman, J.V. Melo // N. Engl. J. Med. — 2003. — V 349, №15. — P. 1451—1464.
5. Сорочинская У.Б. Применение метода ДНК-комет для оценки повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды / У.Б. Сорочинская, В.М. Михай-ленко // Онкология. — 2008. — Т. 10, № 3. — С. 303—309.
6. Dusinska M. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions / Maria Dusinska, Andrew R. Collins // Mutagenesis. — 2008. — V. 23, № 3. — P. 191—205.
7. Trzeciak A.R. A Modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Repair Capacity in Human Populations / A.R. Trzeciak, J. Barnes, M.K. Evans // Radiation Research. — 2008. — V. 169, № 1. — P. 110—121.
8. Relationships between acute reactions to radiotherapy in head and neck cancer patients and parameters of radiation-induced DNA damage and repair in their lymphocytes / J. Rzeszowska-Wolny, O. Palyvoda, J. Polanska [et al.] // Int. J. Radiat. Biol. — 2008. — V. 84, № 8. — P. 635—642.
9. Чорна І.В. Оцінка індукованих радіацією пошкоджень ДНК та їхньої репарації у клітинах лінії К562 мієлогенної лейкемії людини / І.В. Чорна, І.Ю. Висоцький // Современные проблемы токсикологии. — 2010. — №1. — С. 42—46.
10. Collins A.R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay / Andrew R. Collins // Mutat. Res. — 2009. — V. 681, № 1. — P. 24—32.
11. The comet assay: topical issues / A.R. Collins, A.A. Oscoz, G. Brunborg [et al.] // Mutagenesis. — 2008. — V. 23, № 3. — P. 143—151.
12. Willers H Repair of radiation damage to DNA / H. Willers, J. Dahm-Daphi, S.N. Powel // Br J Cancer — 2004 — V 90, № 7 — Р 1297—1301.
13. Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах крови человека, облученных в адаптирующей дозе / А.Н. Осипов, Е.Ю. Лизунова, Н.Ю. Воробьева, И.И. Пелевина // Радиац. биология. Радиоэкология. — 2009. — Т. 49. № 1. С. 42—45.
14. Seymour C.B. Relative contribution of bystander and targeted cell killing to the low-dose region of the radiation dose-response curve / Colin B. Seymour, Carmel Mothersill // Radiat. Res. — 2000. — V. 153, № 5. — P. 508—511.
15. Radiation-induced intercellular signaling mediated by cytochrome-c via a p53-dependent pathway in hepatoma cells / M He, M Zhao, B Shen [et al.] // Oncogene. — 2011. — V. 30, № 16. — P. 1947—1955.
16. Lopez-Lazaro M. Dual role of hydrogen peroxide in cancer: possible relevance to cancer chemoprevention and therapy / M. Lopez-Lazaro //Cancer Letters. — 2007 — V 252, № 4 — Р. 1—8
REFERENCES
1. Alexandrova S.A. Genetic variability of the mouse hepatoma cells MH-22a revealed by RAPD-PCR-fingerprinting under different conditions of cultivation / S.A. Alexandrova, I.N. Shvemberger // Exp. Oncol. — 2005. — V. 27, № 2. — P. 114—119.
2. Svirnovski A. Attemts to influence the drug resistance of tumor cells in experimental system / A. Svirnovski, V. Pasiukov // Exp Oncol. — 2005. — V. 27, № 1. — P. 43—46.
3. Svirnovskij A.I. Molekulyarnye osnovy fenomena khi-mio- i radiorezistentnosti pri opukholevykh processakh / A.I. Svirnovskij, V.V. Pasyukov // Medicinskie novosti. — 2007. — № 11. — S. 7—19.
4. Goldman J.M. Chronic myeloid leukemia — advances in biology and new approaches to treatment / J.M. Goldman, J.V. Melo // N. Engl. J. Med. — 2003. — V 349, №15. — P. 1451—1464.
5. Sorochinskaya U.B. Primenenie metoda DNK-komet dlya ocenki povrezhdenij DNK, vyzvannykh razlichnymi agentami okruzhayuschej sredy / U.B. Sorochinskaya, V.M. Mikhaj-lenko // Onkologiya. — 2008. — T. 10, № 3. — S. 303—309.
6. Dusinska M. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions / Maria Dusinska, Andrew R. Collins // Mutagenesis. — 2008. — V. 23, № 3. — P. 191—205.
7. Trzeciak A.R. A Modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Repair Capacity in Human Populations / A.R. Trzeciak, J. Barnes, M.K. Evans // Radiation Research. — 2008. — V. 169, № 1. — P. 110—121.
8. Relationships between acute reactions to radiotherapy in head and neck cancer patients and parameters of radiation-induced DNA damage and repair in their lymphocytes / J. Rzeszowska-Wolny, O. Palyvoda, J. Polanska [et al.] // Int. J. Radiat. Biol. — 2008. — V. 84, № 8. — P. 635—642.
9. Chorna I.V. Ocinka indukovanykh radiacieyu poshkodzhen' DNK ta ikhn'oi reparacii u klitynakh linii K562 mielogennoi lejkemii lyudyny / I.V. Chorna, I.Yu. Vysoc'kyj // Sovremennye problemy toksykologyy. — 2010. — №1. — S. 42—46.
10. Collins A.R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay / Andrew R. Collins // Mutat. Res. — 2009. — V. 681, № 1. — P. 24—32.
11. The comet assay: topical issues / A.R. Collins, A.A. Oscoz, G. Brunborg [et al.] // Mutagenesis. — 2008. — V. 23, № 3. — P. 143—151.
12. Willers H Repair of radiation damage to DNA / H. Willers, J. Dahm-Daphi, S.N. Powel // Br J Cancer — 2004 — V 90, № 7 — Р 1297—1301.
13. Indukciya i reparaciya dvunitevykh razryvov DNK v limfocitakh krovi cheloveka, obluchennykh v adaptiruyuschej doze / A.N. Osipov, E.Yu. Lizunova, N.Yu. Vorob'eva, I.I. Pelevina // Radiac. biologiya. Radioekologiya. — 2009. — T. 49. № 1. S. 42—45.
14. Seymour C.B. Relative contribution of bystander and targeted cell killing to the low-dose region of the radiation dose-response curve / Colin B. Seymour, Carmel Mothersill // Radiat. Res. — 2000. — V. 153, № 5. — P. 508—511.
15. Radiation-induced intercellular signaling mediated by cytochrome-c via a p53-dependent pathway in hepatoma cells / M He, M Zhao, B Shen [et al.] // Oncogene. — 2011. — V. 30, № 16. — P. 1947—1955.
16. Lopez-Lazaro M. Dual role of hydrogen peroxide in cancer: possible relevance to cancer chemoprevention and therapy / M. Lopez-Lazaro //Cancer Letters. — 2007 — V 252, № 4 — Р. 1—8
Надійшла до редакції 9.04.2012 р.