При широкому застосуванні пестицидів у сільському господарстві особливого значення набуває перевірка їх токсичного впливу на тваринний та людський організми [2-7, 10, 12, 14, 15]. Одним з важливих етапів токсиколого-гігієнічної перевірки нових пестицидів є визначення їх гострої токсичності. Метою даної роботи було визначити напівле-тальну дозу (ЛД50) нових пестицидів: "БарКот 5" (діюча речовина: карбендазим — 500 г/л) та "Віспар" (діючі речовини: карбоксин — 350 г/л, тирам — 350 г/л) [8] при пероральному введенні для представника класу птахів — японського перепела (Coturnix coturnix japonica). Матеріали і методи досліджень Дослідження було проведено на 118 самцях і 91 самиці японського перепела (Coturnix coturnix japonica) 6-7-тижневого віку. Птахів утримували в умовах стаціонарного віварію, кожна експериментальна група знаходилася в окремій клітці, призначеній саме для вирощування птахів. Світловий режим: 16 годин — світло, 8 годин — темрява. Температура повітря у віварії підтримувалася на рівні +22°С. Вода подавалась без обмежень у спеціальних пташиних поїлках; воду замінювали 1 раз на добу. Годівлю проводили без обмежень комбікормом для перепелів марок ПК 1 22П та ПК 1 18П виробництва АТ "Київ-Атлантик Україна".
Основні етапи досліджень були проведені у відповідності з методичними вказівками по гігієнічній оцінці нових пестицидів [9], правилами Американської агенції з охорони навколишнього середовища для пестицидів і токсичних субстанцій [1] та іншими рекомендаціями з токсикологічних досліджень [2, 4, 7, 11, 12, 15].
Для приблизного визначення токсичної дози вищевказаних пестицидів спочатку були проведені попередні дослідження. Для цих досліджень було взято 27 самців японських перепелів, з яких було сформовано експериментальні групи по 3 самці у кожній групі. Птахам кожної групи одноразово перорально за допомогою спеціально переобладнаного шприца вводили пестицид "БарКот-5" у дозах 1000, 5000, 20000, 40000, 50000 мг/кг маси тіла; пестицид "Віспар" у дозах 1000, 2000, 5000, 10000 мг/кг маси тіла. Дозу препарату розраховували індивідуально для кожного птаха, виходячи з маси його тіла. Після введення препарату за піддослідними птахами перші 2-3 години вели неперервні спостереження, а потім — періодичні через кожні 2-3 години (для перших 12 годин після введення препарату) і через кожні 12 годин протягом наступних 3-х діб. Спостерігали за наявністю чи відсутністю симптомів отруєння, часом їх появою та зникненням, а також реєстрували час загибелі (якщо смерть мала місце) кожного піддослідного птаха. Результати попередніх досліджень були використані для планування основних досліджень.
З метою остаточного визначення напівлетальної дози кожного пестициду були проведені основні дослідження. Для основних досліджень було використано 91 самця та 91 самицю японського перепела. Після отримання птахи були акліматизовані до умов віварію. Щоб врахувати можливі статеві відмінності в чутливості перепелів до пестицидів, у кожну експериментальну групу брали однакову кількість самців та самиць. З цих перепелів було сформовано 13 експериментальних груп (по 7 самців і 7 самиць у кожній групі) (див. табл. 1 та табл. 2).
Безпосередньо перед введенням пестициду птахів зважували. Дозу препарату розраховували індивідуально для кожного птаха, виходячи з маси його тіла. Пестицид "Бар Кот-5" давали у дозах: 10000 мг/кг, 15000 мг/кг, 20000 мг/кг, 25000 мг/кг, 30000 мг/кг, 40000 мг/кг маси тіла. Пестицид "Віспар" давали у дозах: 1000 мг/кг, 1500 мг/кг, 2000 мг/кг, 3000 мг/кг, 4000 мг/кг маси тіла. Відповідну кількість пестицидів "Бар Кот 5" та "Віспар" вводили перорально одноразово за допомогою спеціально переобладнаного шприца. Контрольним групам аналогічним чином давали чисту дистильовану воду.
Після введення відповідного пестициду за птахами вели неперервні спостереження перші 3 години після введення препарату, а потім — регулярні через 6, 12, 24, 36 та 48 годин після введення препарату, а в подальшому — 1 раз на добу. Спостерігали за наявністю чи відсутністю симптомів отруєння, часом їх появи та зникнення, а також, — за часом загибелі (якщо смерть мала місце) кожного піддослідного птаха. Спостережний період при введенні пестициду "Віспар" становив 14 діб. При введенні пестициду "БарКот-5" спостережний період був розширений до 21 доби (оскільки симптоми отруєння тривали довго). Результати цих спостережень наведені у таблицях 1 та 2.
Напівлетальну дозу (ЛД50) кожного пестициду розраховували методом графічного пробіт-аналізу [13, 15]. Стандартну похибку розраховували за формулою [15]:
95% довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05) підраховували за формулою [15]:
S LD50 — стандартна похибка напівлетальної дози;
Таблиця 1
Смертність та симптоми отруєння в японських перепелів після однократного введення різних доз препарату "БарКот-5"
ALD50 — довірчий інтервал напівлетальної дози; t — t-критерій Стьюдента при P<0,05 і числі ступенів свободи f-1, де f - кількість тварин, використана в експерименті; LD84 — доза, при якій гине 84 % особин, відповідає пробіту 6; LD16 — доза, при якій гине 16 % особин, відповідає пробіту 4; N — кількість тварин в групах, для яких пробіти знаходяться між 3,5 і 6,5 [15].
Результати досліджень та їх обговорення
Попередні дослідження. Результати попередніх досліджень показали, що при введенні пестициду "Бар Кот-5" легкі симптоми отруєння з'являються у піддослідних птахів при його введенні у дозі 1000 мг/кг маси тіла і не супроводжуються смертністю. При введенні цього пестициду в дозах 5000 та 20000 мг/кг гине 33,3 % особин; при введенні у дозі 40000 мг/кг — 66,7 %, а при введенні у дозі 50000 мг/кг має місце 100 % смертність. Тобто, попередні дослідження свідчать, що напівле-тальна доза (LD50) препарату "Бар Кот-5" для птахів, швидше всього, знаходиться між 20000 мг/кг маси тіла та 40000 мг/кг маси тіла.
При введенні пестициду "Віспар" у дозі 1000 мг/кг маси тіла ніхто з перепелів не гине, при його введенні у дозі 2000 мг/кг маси тіла гине 2 із 3 птахів, а при введенні у дозах 5000 та 10000 мг/кг маси тіла гинуть всі перепели. Отже, на основі попередніх досліджень можна зробити висновок, що напівлетальна доза (LD50) препарату "Віспар" для птахів знаходиться між 1000 мг/кг маси тіла та 5000 мг/кг маси тіла.
Основні дослідження. Для точного визначення напівлетальної дози (LD50) вищезазначених пестицидів були проведені основні дослідження.
Як уже було зазначено, піддослідні птахи були до початку експерименту акліматизовані. Під час акліматизації ніхто з перепелів не загинув і в жодної особини не було помітно будь-яких ознак хвороб.
У перепелів контрольних груп, які отримували чисту дистильовану воду, фактів смертності та будь-яких симптомів отруєння чи аномальної поведінки не зафіксовано.
Введення пестициду "БарКот-5". Показники смертності та основні симптоми отруєння при введенні пестициду "БарКот-5" представлені у таблиці 1. Видно, що при пероральному введенні цього пестициду майже єдиними симптомами отруєння є "опущене пір'я" і гіпоактивність. Однак ці симптоми тривають дуже довго, до 2 тижнів. Смертність також дуже розтягнута в часі (протягом 2 тижнів), без чітко вираженого піка.
Рис. 1. Крива "доза-ефект" для пестицидів "БарКот-5" та "Віспар" при їх введенні японським перепелам.
Методом графічного пробіт-аналізу було розраховано напівлетальну дозу (ЛД50) пестициду "БарКот-5", яка відповідає значенню X на кривій "доза-ефект" при Y=5, і становить 27036 мг/кг маси тіла (рис. 1А). Стандартна похибка, визначена за формулою (1), становить:
95 % й довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05) підрахований за формулою (2) і становить:
Отже, напівлетальна доза (ЛД50) пестицида "БарКот-5" для птахів (японських перепелів, Coturnix coturnix japonica) при пероральному однократному введенні становить 27036± 2102 мг/кг маси тіла, а 95 % й довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05) — від 22917 до 31155 мг/кг маси тіла.
Введення пестициду "Віспар". Показники смертності та основні симптоми отруєння при введенні пестициду "Віспар" представлені у таблиці 2. Основними симптомами отруєння пестицидом "Віспар" при нижчих дозах (1000-2000 мг/кг маси тіла) є гіпоактивність і реакція "опущене пір'я", а при вищих дозах (30004000 мг/кг маси тіла) до цих симптомів додаються "п'яна хода", утруднене дихання, "тріпотіння крил", стрибки і конвульсії. Смертність має місце протягом 3 діб від моменту введення пестициду. У виживших перепелів симптоми отруєння зникають через 24 доби після введення даного пестициду. Самці є більш чутливими до "Віспару" ніж самиці.
Визначення напівлетальної дози (ЛД50) пестициду "Віспар" методом графічного пробіт-аналізу показало, що вона становить 2761 мг/кг маси тіла (рис. 1Б). Стандартна похибка, визначена за формулою (1), становить:
95 % й довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05) підрахований за формулою (2) і становить:
Отже, напівлетальна доза (ЛД50) пестициду "Віспар" для птахів (японських перепелів, Coturnix coturnix japonica) при пероральному однократному введенні становить 2761± 174 мг/кг маси тіла, а 95 % й довірчий інтервал (довірчий інтервал при P<0,05) — від 2420 до 3102 мг/кг маси тіла.
Таблиця 2
Смертність та симптоми отруєння в японських перепелів після однократного введення різних доз препарату "Віспар"
ЛІТЕРАТУРА
1. Guidelines United States Environmental Protection Agency: Pesticides and Toxic Substances: Avian acute oral toxicity test. — Washington, 1996.
2. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов. /[ Е.Ю. Афанасьева, Е.Я. Борисова, О.Л. Верста-кова и др.] — Москва: ГЭОТАР — Медиа, 2008. — 1016 с.
3. Экологическая токсикология. /[В.С. Безель, Е.А. Бельс-кий, Д.В. Веселки и др.] — Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2001. — 135 с.
4. Токсикологічна хімія з експрес-аналізом гострих інтокси-кацій. /[В.С. Бондар, О.О. Маміна, С.А. Карпушина и др.] — Харків: Видавництво НфаУ, 2004. — 79 с.
5. Захаренко А.В. Гербициды. / А.В. Захаренко — Москва: Изд-во МСХА, 2000. — 95 с.
6. Ісаєнко В.М. Основи екологічної токсикології. / В.М. Ісаєн-ко — Київ: НАУ, 2007. — 67 с.
7. Основы токсикологии. / [П.П. Кукин, Н.Л. Пономарев, К.Р. Та ранцева и др.] — Москва: Высшая школа, 2008. — 279 с.
8. Пестициды: Справочник. / [В.И.Мартыненко, В.К. Промоненков, С.С. Кукаленко и др.] — Москва: Агропромиздат, 1992. — 368 с.
9. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. — Киев, 1988. — 212 с.
10. Михайловська Т.М. Екологічна токсикологія. / Т.М. Ми-хайловська — Чернівці: Рута, 2007. — 88 с.
11. Михайловська Т.М. Методи аналізу токсикологічної хімії. / Т.М Михайловська. — Чернівці: Рута, 2007. — 88 с.
12. Токсикологическая химия. / [Т.В. Плетнева, Е.М. Сало-матин, А.В. Сыроешкин и др.] — Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2006. — 509 с.
13. Плохинский Н.А. Математические методы в биологии. / Н.А. Плохинский — Москва: Изд-во Московского ун-та, 1978. — 265 с.
14. Основи токсикології. / [Г.Г. Рощин, А.П. Строкань, А.С. Тимченко и др. ] — Київ: КНУТД, 2007. — 138 с.
15. Ступников А.А. Токсичность гербицидов и арборицидов и профилактика отравлений животных. / А.А. Ступников — Ленинград: Колос, 1975. — 240 с.
REFERENCES
1. Guidelines United States Environmental Protection Agency: Pesticides and Toxic Substances: Avian acute oral toxicity test. — Washington, 1996.
2. Toksikologicheskaya khimiya. Metabolizm i analiz toksikantov. /[ E.Yu. Afanas'eva, E.Ya. Borisova, O.L. Versta-kova i dr.] — Moskva: GEOTAR — Media, 2008. — 1016 s.
3. Ekologicheskaya toksikologiya. /[V.S. Bezel', E.A. Bel's-kij, D.V. Veselki i dr.] — Ekaterinburg: Izd-vo Ural'skogo un-ta, 2001. — 135 s.
4. Toksykologichna khimiya z ekspres-analizom gostrykh intoksy-kacij. /[V.S. Bondar, O.O. Mamina, S.A. Karpushyna y dr.] — Kharkiv: Vydavnyctvo NfaU, 2004. — 79 s.
5. Zakharenko A.V. Gerbicidy. / A.V. Zakharenko — Moskva: Izd-vo MSKhA, 2000. — 95 s.
6. Isaenko V.M. Osnovy ekologichnoi toksykologii. / V.M. Isaen-ko — Kyiv: NAU, 2007. — 67 s.
7. Osnovy toksikologii. / [P.P. Kukin, N.L. Ponomarev, K.R. Ta ranceva i dr.] — Moskva: Vysshaya shkola, 2008. — 279 s.
8. Pesticidy: Spravochnik. / [V.I.Martynenko, V.K. Promonenkov, S.S. Kukalenko i dr.] — Moskva: Agropromizdat, 1992. — 368 s.
9. Metodicheskie ukazaniya po gigienicheskoj ocenke novykh pesticidov. — Kiev, 1988. — 212 s.
10. Mikhajlovs'ka T.M. Ekologіchna toksikologіya. / T.M. Mikhajlovs'ka — Chernіvcі: Ruta, 2007. — 88 s.
11. Mikhajlovs'ka T.M. Metodi analіzu toksikologіchnoї khіmії. / T.M Mikhajlovs'ka. — Chernіvcі: Ruta, 2007. — 88 s.
12. Toksykologycheskaya khymyya. / [T.V. Pletneva, E.M. Salo-matyn, A.V. Syroeshkyn y dr.] — Moskva: GЭOTAR-Medya, 2006. — 509 s.
13. Plokhynskyj N.A. Matematycheskye metody v byologyy. / N.A. Plokhynskyj — Moskva: Izd-vo Moskovskogo un-ta, 1978. — 265 s.
14. Osnovy toksykologii. / [G.G. Roschyn, A.P. Strokan', A.S. Tymchenko y dr. ] — Kyiv: KNUTD, 2007. — 138 s.
15. Stupnikov A.A. Toksichnost' gerbicidov i arboricidov i profilaktika otravlenij zhivotnykh. / A.A. Stupnikov — Leningrad: Kolos, 1975. — 240 s.
Надійшла до редакції 24.10.2013 р.